Protocolo de mejora para la inmunoprecipitación de cromatina de músculo esquelético de ratón
Summary
Se presenta un nuevo protocolo para la preparación de la cromatina de músculo esquelético de ratón adulto adaptado al estudio de la regulación de los genes en las fibras musculares por inmunoprecipitación de cromatina.
Abstract
Se describe un protocolo eficiente y reproducible para la preparación de la cromatina de músculo esquelético de ratón adulto, un tejido resistente físicamente con un alto contenido de proteínas estructurales. Disecada extremidades músculos de ratones adultos físicamente se interrumpen por homogeneización mecánica, o una combinación de picado y douncing, en un tampón hipotónico antes de fijación formaldehído de la célula lisada. Los núcleos fijos son purificados por más ciclos de homogeneización mecánica o douncing y filtraciones secuenciales para eliminar restos celulares. Los núcleos purificados pueden ser sonicados inmediatamente o en una etapa posterior después de congelar. La cromatina puede ser sonicada eficientemente y es conveniente para los experimentos de inmunoprecipitación de cromatina, como lo demuestran los perfiles obtenido para factores de transcripción, ARN polimerasa II y modificaciones covalentes de histonas. Los eventos de enlace detectados con cromatina preparada por este protocolo son predominantemente aquellos que toman lugar en los núcleos de la fibra muscular a pesar de la presencia de cromatina de otro satélite de fibra-asociada y las células endoteliales. Este protocolo, por tanto, se adapta para estudiar la regulación de los genes en el músculo esquelético de ratón adulto.
Introduction
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) se han convertido en los métodos de elección para el estudio de transcripción y regulación epigenética de la expresión génica en distintos tejidos y tipos de la célula1. Esta técnica permite perfiles de genoma de modificaciones covalentes de la cromatina, ocupación variante de la histona y transcripción factor vinculante2,3.
Mientras que realizar ChIP de células cultivadas está bien establecida, ChIP de tejidos mamíferos sigue siendo más difícil. Preparación de cromatina chip implica varios pasos críticos que necesitan ser optimizados para todo tipo de tejidos y células. La cromatina puede ser preparada de los lisados celulares de las células cultivadas o purificación siguiente de sus núcleos. En el caso de tejidos mamíferos, lisis eficiente fijación formaldehído y purificación de núcleos son críticos para asegurar la óptima recuperación de la cromatina. Por otra parte, la elección de fijar los núcleos antes o después de su purificación debe determinarse experimentalmente. A pesar de estos obstáculos, el ChIP se ha realizado con éxito de tejidos como el hígado, testículo, cerebro4,5,6. En el caso del músculo esquelético, la interrupción de un tejido resistente físicamente, que exhibe un alto contenido de proteínas estructurales y el aislamiento de sus núcleos es particularmente desafiante. Dada esta especificidad, protocolos optimizados para otros tejidos no dan resultados satisfactorios para los músculos esqueléticos.
Aquí se describe un protocolo para aislar la cromatina ChIP-grado de tejido de músculo esquelético de ratón que consiste en alterar físicamente el tejido, fijación de formaldehído y el aislamiento de núcleos y sonicación. La eficacia de este método para preparar conveniente para el ChIP de este tejido la cromatina fue demostrada realizando qPCR ChIP y ChIP-seq para varios factores de transcripción, ARN polimerasa II y de modificaciones covalentes de histonas7.
Esta nueva técnica es mucho más rápida que un protocolo previamente divulgados8 que comprende largos pasos de digestión colagenasa durante ese tiempo, cambios en la localización genómica de factores de transcripción y pueden ocurrir alteraciones en la expresión génica. La rapidez con que los núcleos son aislados y fijo hace que el método descrito aquí particularmente atractiva para preparar cromatina que refleja más fielmente el estado nativo ocupación genómica. Por otra parte, aunque tienen otros métodos para la extracción de proteína o aislamiento de cromatina de tejido muscular han sido descrito8,9,10 y utilizado para los experimentos de ChIP-qPCR en genes seleccionados, sin ChIP-seq se ha reportado datos usarlos. El método aquí es conveniente para la transcripción factor e histona modificación ChIP-seq y por lo tanto debe ser también adecuado para 3 / 4C o aplicaciones de captura de conformación de la cromatina de HiC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un nuevo protocolo para la preparación de cromatina de músculo esquelético de ratón adulto y muestran que esta cromatina es conveniente para los experimentos de ChIP que detectan modificaciones covalentes de la histona y atascamiento del factor de transcripción en los núcleos de la fibra muscular. Este protocolo implica varios pasos críticos. El primero es tejido que se pueden realizar por corte mecánico o dounce. Corte mecánico es más rápido y más reproducible y por lo tanto es el método d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todo el personal de la planta de secuenciación de alto rendimiento IGBMC, miembro del consorcio “Francia Génomique” (ANR10-INBS-09-08) y todos los servicios generales de IGBMC en particular el personal de la instalación animal IGBMC. Este trabajo fue financiado por becas del CNRS, INSERM, la AFM, la Ligue Nationale contre le Cancer, los franceses del estado fondo a través de la ANR en el programa Investissements Avenir con ANR-10-IDEX-0002-02, la empresa Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 y la ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito. S.J fue apoyado por la Ligue Nationale contre le cáncer de la ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 y V.U por el Ministère de l ‘ enseignement et de la Recherche. ID es un ‘équipe labellisée’ de la Ligue Nationale contre le cáncer.
Materials
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
Riferimenti
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington’s disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N., DiMario, J. . Myogenesis: Methods and protocols. 798, 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- . ChIP Analysis Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017)
