Summary
Detta stegvisa protokoll analyserar Drosophila negativa geotaxis beteende med hjälp av ett automatiserat flercylindriga system som är värd hundratals flugor och synkroniserar sina åtgärder av en elmotor. Vid synkronisering, har flyga negativa geotaxis beteende analyserats, digitalt inspelade och analyseras med hjälp av egendesignade RflyDetection programvara.
Abstract
Neurodegenerativa sjukdomar är ofta associerade med en progressiv förlust av rörelse förmåga, minskad livslängd och åldersberoende neurodegeneration. För att förstå mekanismen av dessa cellulära används händelser och deras kausala relationer med varandra, Drosophila melanogaster, med dess sofistikerade genetiska verktyg och olika beteendemässiga egenskaper, som sjukdomsmodeller för att bedöma neurodegenerativa fenotyper. Här beskriver vi en hög genomströmning metod för att analysera Drosophila vuxen negativa geotaxis beteende, som en indikation för eventuella motoriska brister är associerad med neurodegeneration. En automatiserad maskin är utformad och utvecklad till drive flyga synkronisering med en inledande elektrisk impuls, senare tillåter inspelning av negativa geotaxis beteende under en sekunder till minuter. Bilder från digitalt inspelade videon behandlas sedan med egendesignade RflyDetection programvara för statistisk datamanipulation. Skiljer sig från manuellt styrda negativa geotaxis analysen utifrån enstaka fluga, detta exakt, snabb och hög genomströmning protokoll tillåter datainsamling från mer än hundra flugor samtidigt, ger en effektiv strategi att föra vår förståelse i den underliggande mekanismen vid rörelseapparaten underskott är associerad med neurodegeneration.
Introduction
En mängd protokoll och metoder har utvecklats för att analysera Drosophila vuxen klättring beteende. Ganska mödosam, den traditionella analysen mestadels innebär att sätta en enda fluga in en enskilda injektionsflaskan och använder en manuell kraft för att knacka flyger ner för synkronisering1,2,3,4. Det är tråkiga och tidskrävande, olämpliga för stora hög genomströmning studier och har potentiella variationer av manuell kraft används för att knacka ner flugorna samt andra begränsningar. För att förbättra analysen, utvecklades en snabb iterativ negativa Geotaxis (RING) analys som tillåter hög genomströmning analys över många flugor på samma gång5. Analysen kräver dock fortfarande en manuellt att utöva kraft att synkronisera flyga åtgärder. Vår version av RING analysen, reviderade vid den föregående analysen, inkluderar en metall bas värd flera fluga-innehållande injektionsflaskor kontrolleras automatiskt av en elektrisk motor att köra flyga synkronisering6. Vid inspelning, flugan klättring omedelbart efter synkronisering registreras sedan analyseras med en egendesignade programvara. Våra automatiserade RING assay har elimineras långtråkig och arbetsintensiva processen att samla in data från en enda fluga, en i taget, och aktiverat förvärvsprocessen data effektivare. Dessutom har automatiserade RING analysen varit anställd i ett antal studier för att klarlägga mekanism underliggande Alzheimers och Parkinsons sjukdom, validera metoden med hög effektivitet7,8,9 .
I denna artikel visar vi automatiserad RING analysen använder DDC-Gal4 driven RNAi flugor. DDC-Gal4 är en Gal4 linje specifikt uttrycker i dopaminerga (DA) och serotonerga neuroner, som alltså representerar ett bra verktyg för att analysera de mål genen effekter i samband med rörelseapparaten underskott åtföljer neurodegeneration10. Dessutom, införliva vi UAS-Dicer2, en linan som förbättrar RNAi effektivitet, för att generera UAS-Dicer2; DDC-Gal4 verktyget line. RNAi flugorna vi väljer att använda är den auxilin (aux), RNAi v16182 (auxR16182), en gen som vi har tidigare identifierat att ställa ut en effekt på flyga rörelseaktivitet8. auxGFP flugor är också förberedda för att analysera effekterna på aux överuttryck. Vi visar hur du använder automatiserad RING analysen att mäta flyga negativa geotaxis, presentera resultat och diskutera eventuella konsekvenser som förvärvats från resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. flyga samling
- hålla flugorna på standard flyga mat på 25 ° C, 70% luftfuktighet och en 12 h/12 h ljus/mörk cykel.
- Samla UAS-Dicer2; DDC-GAL4 flyga virginsunder koldioxid (CO 2) anestesi.
- Korsa dessa oskulder till 2 dagar gamla vuxna manliga flugor bär de följande genotyperna: UAS-mCD8GFP (kontroll), auxR 16182 (aux RNAi) auxGFP (aux överuttryck), och auxR 16182; auxGFP (rädda), med en manlig: kvinnliga förhållandet 1:2.
- Separat samla nyligen eclosed hanar och honor i 3 injektionsflaskor för varje grupp per experiment, att placera 10 flugor i regelbundna flyga en injektionsflaska med standard mat vid 25 ° C.
- Beroende på experimentet, hålla den insamlade flyger upp till 35 dagar och använda dem för automatiserad RING analys på dag 5, 15, 25 och 35.
2. Automatiserad RING Assay
- överföra 10 insamlade flugor (unisex) per genotyp i varje injektionsflaska, sedan säkra injektionsflaskan med en skruv. Analysera kontroll flugor och flugor som transporterar olika genotyper tillsammans för varje uppsättning experiment (upp till 10 flaskor samtidigt, 10 flugor i varje injektionsflaska).
- Slå på den digitala kameran placeras framför apparaten och starta inspelning en gång flugor är alla laddade och redo.
- Efter att 1 min för flugor att bosätta sig i injektionsflaskor, slå på steg handkontroll som styr steg föraren; detta driver små elmotorn att styra spaken fäst så att det i följd stiger och kranar apparaten 4 gånger i 2 s. Se figur 1.
- Efter avlyssning, Observera att flugorna börjar stiga upp väggen. Se till att inspelningen fortsätter.
- Upprepa synkronisering enligt beskrivningen i steg 2,3 i 60-s intervall för 3 till 5 på varandra följande försök.
- Upprepa experimentet för 5, 15, 25 och 35 dagar gamla flugor. Genomföra minst 3 oberoende experiment för varje grupp, varje experiment med minst 30 insamlade flugor (3 flaskor).
3. Dataanalys
- Importera det inspelade videoklippet till datorn.
- Ta en ögonblicksbild av videon på 6 s efter avlyssning, för varje prövning.
- Importera ögonblicksbild bilden till RflyDetection programvaran (se figur 2), med den ' fil ' menyn.
- Ställ injektionsflaskan övre och nedre baslinjer just genom att använda ikonen baslinjen i verktygsfältet och sedan använda markören för att markera de övre och nedre baslinjerna på bilden.
- Mata in antalet flugor per injektionsflaska (t.ex., 10 här) i den ' Flys i rekt ' fält och injektionsflaska längd (t.ex., 14 cm här) i den ' Tube höjd ' fält inom fältet Inställningar.
- Obs att de enskilda flyga positionerna upptäcks och märkt med prickar på skärmen för varje injektionsflaska.
Obs: Figur 2 visar positionerna för alla menyn knappklick.
- Obs att de enskilda flyga positionerna upptäcks och märkt med prickar på skärmen för varje injektionsflaska.
- Obs att programvaran automatiskt avgör klättring avståndet för varje fluga och visar i genomsnitt värdena från 10 flugor i varje injektionsflaska i en tabell på den högra panelen. (Se figur 2)
- Bearbeta klättring numret med statistisk programvara (t.ex., prisma) för ytterligare statistisk analys.
- Nuvarande data som menar ± SEM.
- Beräkna p-värden betydelse (anvisas med en asterisk, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001) med envägs ANOVA med Bonferroni flera jämförelse test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna artikel visar användning av en automatiserad RING analys vid bedömningen av flyga negativa geotaxis beteende. Till skillnad från tidigare RING analysen, vår analys inkluderar en automatisk apparat som ger en elektrisk kraft att synkronisera flyga åtgärder och analyserar upp till hundratals flugor samtidigt (figur 1). Analys av Dicer2; DDC > auxR16182 flugor visade en åldersberoende minskning klättring avståndet i en 6-s tidsram för både manliga och kvinnliga flugor, vilket tyder på att aux uttryck i DA nervceller är avgörande för flyga rörelseaktivitet. Klättring förmåga verkar inte påverkas vid auxGFP överuttryck i DA nervceller, och samtidig uttryck för auxR16182 och auxGFP i DA nervceller räddade RNAi fenotypen (figur 2 och figur 3). Förutom att validera automatiserad RING analysen som en hög genomströmning och effektiv strategi för att bedöma motoriska brister är associerad med DA neuron degeneration, indikerar dessa resultat också att detta automatiserade tillvägagångssätt är användbart för att identifiera potentiella Parkinsons sjukdomsrisk faktorer och ger en ledtråd om deras neurodegenerativa funktion.
Figur 1. Automatiserad RING apparaten. (A och B) främre och bakre utsikt över apparaten: socket (1), vertikal stålstav (2), en skruv för att säkra det röret på RAM (3), transparent plast injektionsflaskor (4), skum bar (5), metall bas (6), micro-steg driver (7), elektroniska styrenhet (8), växeln (9), liten elmotor (10) och spaken bifogas små elmotorn (11). Storleken på rektangulära metallramen är 46 cm × 26 cm × 16 cm, håller 10 genomskinlig plast flaskor (2,1 cm i diameter, 14,5 cm i höjd) säkras med skruvar. Slå på apparaten genom först klicka på switch (9), som vänder på (8), (7) och (10) Följaktligen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Analys av ett representativt ögonblicksbild bild av RflyDetection. Ögonblicksbild bilden importeras till programmet RflyDetection och åtgärder för varje ikon i gränssnittet anges med text till höger. Efter inställning topp och botten baslinjer, programvaran automatiskt upptäcker och markerar flyga position inom injektionsflaskan. Det klättring avståndet (cm) i 6 s för varje fluga och de genomsnittliga värdena för varje injektionsflaska visas i en tabell. Dessa nummer importeras sedan till statistiska programvaran för ytterligare statistisk analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Statistiska stapeldiagram som visar en åldersberoende minskning flyga klättringsförmåga aux uttrycket är nedreglerade i DA nervceller. Automatiserad RING analysen användes för att analysera negativa geotaxis beteende för flugor bär de följande genotyperna: auxR16182/ + (ingen Gal4), UAS-Dicer2; DDC-Gal4 flugor korsas till w1118 (kontroll), UAS-mCD8GFP (kontroll), auxR16182, auxGFPoch auxR16182; auxGFP (räddning). Observera att både manliga och kvinnliga flugor stigit betydligt långsammare med tiden när aux uttryck reducerades i DA nervceller. Rörelseapparaten underskotten räddades vid återinföra aux uttryck. Flugor av 5, 15, 25 och 35 dagar gamla bedömdes. (A) manliga och kvinnliga (B) flugor visas separat. Legender med genotyp etiketter motsvarar olika bar färger visas till höger. Uppgifterna presenteras som medelvärdet ± SEM. p-värden betydelse (anvisas med en asterisk, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns: ingen betydelse, en bar drogs nedan stjärnen att ange objekt för att jämföra) beräknades jämföra till mCD8GFP kontroll eller aux RNAi med envägs ANOVA med Bonferroni flera jämförande test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Automatiserad RING analysen beskrivs här möjliggör en hög genomströmning analys av flyga negativa geotaxis beteende för hundratals flugor samtidigt. Tidigare befintliga strategier för att analysera vuxen klättring innebär observationer av en enda fluga i en injektionsflaska av enskilda, och flyga position identifieras manuellt av ögat. Denna ganska långtråkig process kan ibland orsaka felläsning eller feltolkning av data, samt arbetsintensiva arbete. Våra automatiserade RING analysen börjar med ett enkelt klick, och apparaten automatiskt synkroniserar och bedömer klättringsförmåga av upp till 100 flugor. Den elektriska synkroniseringen ger ett mer exakt sätt att kontroll tid och andra parametrar, så den totala infångande av flyga vuxen klättring processen kan mätas noggrant.
Nästa, med våra egendesignade RflyDetection programvara, den exakta flyga positionen kan identifieras. Programvaran tar hänsyn övergripande 2D injektionsflaska område (bestäms av den rektangulär ram), och övre och nedre baslinjer, innan det förvärvade positioner för alla flugor inom det angivna området och presenterar dem som prickar. Automatisk beräkning av klättring avståndet och i genomsnitt värden kan dessutom snabbare och enklare datamanipulation. Datauppsättningar över en stor grupp av flugor kan rimligen samlas in och analyseras inom en rimlig tidsram7,8,9.
Även om en åldersberoende minskning klättring aktiviteten är associerad med neurodegeneration beskrivs här, denna analys är lika effektiv i att analysera rörelseaktivitet relevanta för defekter. I detta syfte är automatiserad RING analysen en användbar och effektiv strategi för att analysera Drosophila negativa geotaxis i något adult Stadium och i antingen normal eller patologisk staten av hjärnans funktion. Dock analysen har begränsad användning i helt analysera alla flugor trots programvaran RflyDetection är möjligheten att manuellt identifiera någon av misstag ouppsamlade ettor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Bloomington lager centrum och stadens Vienna Drosophila RNAi för flyga bestånd. Patent för RING apparaten tillhör Shanghai Advanced Research institute, kinesiska vetenskapsakademin. Ansökningar om RflyDetection programvaran bör göras till Fu-de Huang (se författare lista). Detta arbete stöds av bidrag från nationella grundläggande forskning Program i Kina (973 Program 2013CB945602) och National Natural Science Foundation Kina (31270825 och 31171043). Vi tackar Ho lab medlemmar för diskussion och kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
References
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
- Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741 (2015).
- Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
- Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
- Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson's Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
- Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
- Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).
