جيل من التمييزية مونوكلونل البشرية من خلايا نادرة محددة مستضد ب المتداولة في الدم

Summary

يصف لنا طريقة لإنتاج أجسام مضادة بشرية محددة مستضد الاهتمام، بدءاً من الخلايا ب نادرة المتداولة في الدم البشري. جيل من هذه الأجسام المضادة الطبيعية بكفاءة وسرعة، والأجسام المضادة التي تم الحصول عليها يمكن أن تميز بين المستضدات المتصلة بدرجة عالية.

Abstract

[مونوكلونل] (مابس) أدوات قوية مفيدة لكلا من البحوث الأساسية، وفي الطب الحيوي. خصوصيتها العالية أمر لا غنى عنه عند الجسم يحتاج إلى التمييز بين الهياكل ذات الصلة العالية (مثلاً، بروتين عادي وتحور نسخة منه). الطريقة الحالية لتوليد مثل هذه مابس التمييزية ينطوي فحص واسعة النطاق متعددة الخلايا المنتجة لأب ب، ومكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً على حد سواء. ونحن نقترح هنا طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لتوليد التمييزية، مابس البشرية الكامل بدءاً من الدم البشري تعميم لمفاوية ب. أصالة هذه الاستراتيجية سبب اختيار محددة مستضد ملزمة ب الخلايا جنبا إلى جنب مع التحديد مكافحة كافة الخلايا الأخرى، استخدام متاحة الطرفية الدم وحيدات النوى خلايا (ببمك). مرة واحدة محددة ب الخلايا المعزولة، يتم الحصول على تسلسلات كدنا (تكميلية الحمض الخلوي الصبغي) الترميز ماب المقابلة استخدام تكنولوجيا عكس النسخ-“تفاعل البوليميراز المتسلسل” (RT-PCR) خلية مفردة، وأعربت في وقت لاحق في الإنسان الخلايا. خلال أقل من شهر واحد، فمن الممكن تنتج ملليغرام من مابس البشرية عالية التمييزية ضد أي مستضد المطلوب الكشف عنها بطبيعة الحال بواسطة مرجع الخلية ب.

Introduction

الأسلوب الموصوفة هنا يسمح إنتاج مونوكلونل البشرية الكامل (مابس) ضد مستضد المطلوب (Ag) السريع وتنوعاً. مابس أدوات لا غنى عنها في العديد من تطبيقات البحوث الأساسية في المختبر و في فيفو: التدفق الخلوي، وعلم الأنسجة، والتجارب الغربية النشاف، وحظر على سبيل المثال. وعلاوة على ذلك، مابس تستخدم أكثر فأكثر في الطب لعلاج أمراض المناعة الذاتية، السرطان، ومراقبة زرع الرفض¹. على سبيل المثال، استخدمت مؤخرا مابس 4-مكافحة-كتلاً ومكافحة-PD-1 (أو مكافحة-PD-L1) كمثبطات محصنة ضد نقطة تفتيش في علاجات السرطان².

مابس الأولى تم إنتاجها بواسطة الغلوبولين المناعي (Ig)-إفراز هيبريدوماس التي تم الحصول عليها من خلايا الطحال المحصنين الفئران أو الجرذان. ومع ذلك، يعوق الاستجابة المناعية القوية ضد مابس الفئران أو الجرذان استعمالها العلاجي في البشر، وسبب بهم التخليص السريع وتحريض محتمل من تفاعلات فرط الحساسية³. لمعالجة هذه المشكلة، استبدلت تسلسل البروتين الحيواني مابس جزئيا بالبشرية منها لإنشاء ما يسمى تشيميريك الإنسان الماوس أو أنسنة الأجسام المضادة. ومع ذلك، هذه الاستراتيجية جزئيا فقط يقلل الاستمناع، مع زيادة كبيرة في التكلفة والجدول الزمني للإنتاج. حل أفضل لتوليد مابس البشرية مباشرة من الخلايا ب البشرية وتتوافر استراتيجيات عدة لهذا. واحد منهم هو استخدام عرض بالعاثية أو الخميرة. وهذا ينطوي على عرض مجالات متغير من مكتبة اندماجي عشوائي Ig البشرية الثقيلة وسلاسل الضوء على فاجيس أو الخمائر، والقيام بخطوة اختيار استخدام مستضد معين من الفائدة. عيب رئيسي لهذه الاستراتيجية أن السلاسل الثقيلة والخفيفة وترتبط عشوائياً، مما أدى إلى زيادة كبيرة جداً في تنوع الأجسام المضادة التي تم إنشاؤها. الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها من المحتمل أن تقابل تلك التي ستنشأ عن استجابة جهاز المناعة طبيعية ضد أغ خاصة. وعلاوة على ذلك، طي البروتين البشري والتعديلات بوستترانسلاشونال لا بانتظام مستنسخة في بدائيات النوى، أو حتى في الخمائر. أسلوب إنتاج البشري ماب ثاني هو تخليد للخلايا البشرية الطبيعية ب، بعدوى فيروس ابشتاين-بار أو التعبير عن العوامل المضادة-apoptotic BCL-6 و BCL-XL⁴. ومع ذلك، هذا الأسلوب لا ينطبق إلا على خلايا الذاكرة ب وغير الفعالة، التي تتطلب فحص العديدة المنتجة للإنسان والمحيط الحيوي مخلدة ب الخلايا لتحديد المستنسخين ماب قليلة (أن وجدت) مع خصوصية مستضدي المرجوة. الأسلوب وبالتالي مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً على حد سواء.

ووصف مؤخرا بروتوكولا جديداً لإنتاج مابس البشرية من خلايا ب مفردة معزولة⁵. وهي تعتمد على محسن خلية واحدة عكس النسخ-“تفاعل البوليميراز المتسلسل” (RT-PCR) للتضخيم من كلا الثقيلة-والضوء-سلسلة ترميز شرائح من خلية واحدة بتم فرزها. وهذا يعقب بالاستنساخ والتعبير عن هذه الأجزاء في نظام تعبير حقيقية النواة، مما يسمح لتعمير ماب البشرية الكامل. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح بدءاً من الخلايا ب من المانحين جرى تطعيمهم. كانت حصاد الخلايا بعد التطعيم للحصول على ترددات أعلى من الخلايا ب الموجهة ضد النائب العام المطلوب، وبالتالي الحد من الوقت اللازم لفحص⁶أسابيع عدة. كما تم إنتاج أخرى مابس البشرية الكامل من فيروس نقص المناعة البشرية⁺ (فيروس نقص المناعة البشرية) إصابة المرضى⁷ وسرطان الجلد المرضى⁸. وعلى الرغم من أوجه التقدم هذه، لا يزال هناك لا الإجراءات المتاحة التي تمكن من عزل خلايا ب Ag على حدة مستقلة عن النمط الظاهري الذاكرة أو التردد.

ووصف الإجراء هنا يؤدي إلى كفاءة السابقين فيفو عزل الخلايا ب تعميم البشرية استناداً إلى خصوصيتها في المركز، تليها إنتاج البشرية الكامل محددة مستضد مابس في عالية الغلة ومع وقت فحص منخفضة. الأسلوب لا يقتصر على الذاكرة ب الخلايا أو الخلايا ب إفراز الأجسام المضادة التي يسببها بعد استجابة مناعية، ولكن يمكن أيضا تطبيقها على مرجع الخلية بالسذاجه البشرية. أنه يعمل حتى بدءاً من الخلايا الخاصة بحج ب حاضرا في الترددات المنخفضة جداً مؤشر جيد لكفاءتها. ومبدأ الأسلوب كما يلي: ملطخة الخلايا وحيدات النوى الدم طرفية (PBMC) مع اثنين تيتراميرس عرض المستضد الفائدة، وبعضها يحمل فلوروتشرومي مختلفة (مثلاً، فيكوريثرين (PE) واللوفيكوسيانين (APC))، وأن تيترامير ثالث عرض مستضد وثيق صلة مترافق مع فلوروتشرومي ثالث (مثلاً، Brillant البنفسجي 421 (BV421)). لإثراء لخلايا مستضد ملزمة، ثم هي المحتضنة الخلايا مع حبات مغلفة بمكافحة-PE وتقاسم المنافع المضادة-آسيا والمحيط الهادئ، وفرزها في الخلية الفصل بين الأعمدة. يتم تحديد الكسر خلية APC PE^{+ +} ، الملون مع مجموعة متنوعة من مابس المحددة لمختلف أنواع الخلايا ببمك للسماح بتحديد الخلايا ب، ويتعرض للتدفق الخلوي الخلية الفرز. خلايا ب PE⁺ والجيش الشعبي الكونغولي⁺، لكن “البنفسجي الرائعة”^–، يتم عزل. هذه الخطوة تحديد مكافحة الخلايا التي ليست خلايا ب أو عدم ربط مستضد تيتراميريزيد، ولكن ربط إلى بي أو آسيا والمحيط الهادئ (ستكون هذه الخلايا PE⁺ الجيش الشعبي الكونغولي^– أو PE^– الجيش الشعبي الكونغولي⁺) أو إلى الجزء غير مستضد tetramers المستخدمة (وهذه وسوف تكون الخلايا BV421⁺). كما يتم تحديد الخلايا ب ليست محددة للغاية حانمه مصلحة مكافحة في هذه الخطوة (وستكون هذه الخلايا أيضا BV421⁺). وهكذا، هذا الأسلوب يمكن تنقية الخلايا ب محددة للغاية معربا عن مستقبلات الخلية ب (بكرس) قادرة على التمييز بين اثنين من مولدات المضادات ذات صلة وثيقة جداً. يتم جمع الخلايا ب محددة واحدة في أنابيب وعلى تضخيم PCR Ig كدناس (الأحماض منقوص الأكسجين التكميلية) المستنسخة وأعرب عنها خط خلية بشرية يفرز مفتش مابس.

كدليل على المفهوم، توضح هذه الدراسة كفاءة توليد مابس البشرية، التي تعترف ببتيد التي قدمها فئة histocompatibility رئيسية معقدة (MHC–أنا) جزيء ويمكن أن تميز بين هذا الببتيد وغيرها الببتيدات محملة على نفس MHC–أنا اليل. على الرغم من أهمية مستوى تعقيد هذا Ag، يسمح هذا الأسلوب (ط) الانتعاش عالية الغلة من مابس Ag على حدة؛ (ثانيا) إنتاج مابس قادرة على التمييز بين اثنين Ags هيكلياً الوثيق. هذا النهج يمكن تمديدها للمرضى الذين جرى تطعيمهم أو المصابة دون أي تعديل البروتوكول، ولديها أيضا الفعل نفذت بنجاح في نظام جرذ أنسنة⁹. وهكذا، تصف هذه الدراسة اتباع نهج مرنة وفعالة لتوليد مابس البشرية الكامل الذي يمكن استخدامه في البحوث الأساسية والعلاج المناعي.

Protocol

تم الحصول على عينات الدم الطرفية البشرية كافة من المانحين الكبار مجهول بعد الموافقة عن علم، وفقا للجنة الأخلاقيات المحلية (المؤسسة الفرنسية دو سانغ، EFS، نانت، الإجراء NTS بلير-2016-08). 1-عزل خلايا الدم الطرفية البشرية وحيدات النوى ملاحظة: ابتداء من المواد يمكن أن ي…

Representative Results

بدءاً من ببمك من المانحين صحية، وهذا يعرض مشروع توليد مابس البشرية، التي تعترف الببتيد Pp65495 (Pp65، من الفيروس المضخم للخلايا البشرية) المقدمة من الفئة الرئيسية histocompatibility معقدة أنا (MHC–أنا) جزيء (هلا-A * 0201 HLA-A2). هذه مابس يمكن أن تميز بين هذا المجمع ومجمعات يمثلون الببتيد?…

Discussion

البروتوكول المقترح وسيلة قوية لتوليد مابس البشرية مباشرة من الخلايا الخاصة بحج ب المتداولة في الدم. فهو يجمع بين ثلاثة جوانب هامة: (ط) استخدام المرتبطة تيترامير المغناطيسي تخصيب اليورانيوم، الذي يسمح لعزل السابقين فيفو نادرة حتى ب Ag ملزم الخلايا؛ (ثانيا) استراتيجية النابضة يستخدم ثل?…

Materials

HEK 293A cell line	Thermo Fisher scientific	R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)	Gibco by life technologies	31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)	PAA	K45-001
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4	Ambion	AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8	Invitrogen by Life Technologies	15575-020
Fetal Bovine serum (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Ficoll – lymphocytes separation medium	EuroBio	CMSMSL01-01	density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate	Invitrogen by Life Technologies	S21388	premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate	Invitrogen by thermoFisher scientific	S32362	1mg/ml 2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin	Biolegend	405225	conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor	Miltenyi Biotec	130-042-302/130-090-976
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
CD3 BV510 BD horizon	BD Pharmingen / BD Biosciences	563109	Used dilution 1:20
CD19 FITC	BD Pharmingen / BD Biosciences	345788	Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	561116	Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	338440	Used dilution 1:50
7AAD	BD Pharmingen / BD Biosciences	51-68981E (559925)	Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer	BD Biosciences
8-strip PCR tubes	Axygen	321-10-061
Racks for 96 microtubes	Dominique Dutscher	45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)	Invitrogen by thermoFisher scientific	10777-019	qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free	Gibco	10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer	New England BioLabs	S1316S	5.0 A260unit
Random hexamers	Invitrogen by thermoFisher scientific	N8080127	qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen by thermoFisher scientific	18080-044	qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
dNTP Set, Molecular biology grade	Thermo Scientific	R0182	4*100umol
5LVH1	Eurofins	ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH3	Eurofins	AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVL4_6	Eurofins	CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH5	Eurofins	CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
3HuIgG_const_anti	Eurofins	TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1	Eurofins	GGGAATTCTCACA GGAGACGA	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2	Eurofins	ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk3	Eurofins	CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk4	Eurofins	ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566	Eurofins	GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5	Eurofins	GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'LVl1	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl2	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl3	Eurofins	GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5	Eurofins	GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl6	Eurofins	GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl7	Eurofins	GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5LVl8	Eurofins	GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
3'Cl	Eurofins	CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
3'XhoICl	Eurofins	CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense	Eurofins	GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC	Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade	MP Bio	AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate	Macherey Nagel	743.100.100
Enzyme Age I HF	New England Biolabs	R3552L	20000U/ml
Enzyme SalI HF	New England Biolabs	R3138L	20000U/ml
Enzyme Xho I	New England Biolabs	R0146L	20000U/ml
Enzyme BSIWI	New England Biolabs	R0553L	10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase	Invitrogen by thermoFisher scientific	15224.017	100U (1U/ul)
2X YT medium	Sigma Aldrich	Y1003-500ML
Ampicillin	Sigma Aldrich	10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification	Macherey Nagel	740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent	PolyPlus	101-40
Flat bottom96-well plate	Falcon	353072
V-bottom 96-well plate	Nunc/Thermofisher	055142
Nunc easy 175 cm2 flasks	Nunc/Thermofisher	12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer	eBiosciences	00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates	Nunc/Thermofisher	44-2404-21	high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP)	BD Pharmingen / BD Biosciences	55788
TMB substrate	BD Biosciences	555214
Streptavidin	Sigma	S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column	GE Healthcare	17-0402-01
ÄKTA FPLC	GE Healthcare	18190026
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System	BioRad	7880003