Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

Summary

Descriviamo un metodo per la produzione di anticorpi umani specifici per un antigene di interesse, a partire da rari linfociti B circolanti nel sangue umano. Generazione di questi anticorpi naturali è efficiente e rapido, e gli anticorpi ottenuti in grado di discriminare tra antigeni altamente correlati.

Abstract

Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono potenti strumenti utili per entrambi ricerca fondamentale e della biomedicina. Loro alta specificità è indispensabile quando l’anticorpo è necessario distinguere tra strutture altamente correlate (ad es., una proteina normale e una versione mutata della stessa). L’attuale modo di generare tali mAbs discriminativo coinvolge vasta selezione di più celle di produzione di Ab B, che è sia costoso e richiede tempo. Vi proponiamo qui un metodo rapido ed economico per la generazione di discriminante, mAbs pienamente umana, a partire da sangue umano fare circolare i linfociti B. L’originalità di questa strategia è dovuto la selezione delle celle di associazione B antigene specifico combinato con il Counter-selezione di tutte le altre celle, utilizzando prontamente disponibili Peripheral Blood mononucleari cellule (PBMC). Una volta specifici linfociti B sono isolate, sequenze di cDNA (complementare dell’acido deossiribonucleico) che codifica per il mAb corrispondente sono ottenute utilizzando tecnologia single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) e successivamente espresse in umani cellule. In meno di 1 mese, è possibile produrre milligrammi di mAbs umano altamente discriminante nei confronti di praticamente qualsiasi antigene desiderato naturalmente rilevato dal repertorio musicale delle cellule di B.

Introduction

Il metodo qui descritto consente la produzione rapida e versatile di pienamente umana gli anticorpi monoclonali (mAbs) contro un antigene desiderato (Ag). mAbs sono strumenti essenziali per molte applicazioni di ricerca fondamentale in vitro e in vivo: flusso cytometry, istologia, esperimenti di western blotting e blocchi per esempio. Inoltre, mAbs vengono utilizzati più in medicina per curare le malattie autoimmuni, il cancro e per controllare il rigetto di trapianto¹. Ad esempio, mAb anti-CTLA-4 e anti-PD-1 (o anti-PD-L1) recentemente sono stati usati come inibitori di checkpoint immuni in cancro trattamenti².

Il primo mAbs sono state prodotte da immunoglobulina (Ig)-secernendo ibridomi ottenuti dalle cellule spleniche di topi immunizzati o ratti. Tuttavia, la forte risposta immunitaria contro anticorpi monoclonali murini o ratto ostacola il loro uso terapeutico negli esseri umani, a causa della loro rapida clearance e il probabile induzione di reazioni di ipersensibilità³. Per affrontare questo problema, sequenze di proteine animali di mAbs sono stati parzialmente sostituiti da quelli umani per generare i cosiddetti anticorpi chimerici topo-umani o umanizzati. Tuttavia, questa strategia diminuisce solo parzialmente immunogenicità, aumentando sostanzialmente sia il costo e il tempo-scala di produzione. Una soluzione migliore è quello di generare anticorpi monoclonali umani direttamente da linfociti B umani e sono disponibili diverse strategie per questo. Uno di loro è l’uso del display dei fagi o lievito. Questo comporta la visualizzazione di domini variabili da una libreria combinatoria di Ig umana casuale pesanti e catene leggere su fagi o lieviti e realizzazione di un punto di selezione usando l’antigene specifico di interesse. Un grande svantaggio di questa strategia è che le catene pesanti e chiare sono casualmente associate, portando ad un aumento molto grande nella diversità degli anticorpi generati. Gli anticorpi ottenuti difficilmente corrispondono a quelli che deriverebbero da una risposta immunitaria naturale contro un particolare Ag. Inoltre, modificazioni post-traduzionali e ripiegamento di proteine umane non sono sistematicamente riproducibili nei procarioti o anche nei lieviti. Un secondo metodo di produzione di mAb umana è l’immortalizzazione dei linfociti B umani naturali, dall’infezione del virus Epstein – Barr o espressione dei fattori anti-apoptotico BCL-6 e BCL-XL⁴. Tuttavia, questo metodo è applicabile solo alle cellule di B di memoria ed è inefficiente, che richiede la selezione delle cellule di B immortalizzate mAb-producendo numerose per identificare i cloni di mAb pochi (se presente) con la specificità antigenica desiderata. Il metodo è così costoso e che richiede tempo.

Recentemente è stato descritto un nuovo protocollo per la produzione di mAbs umana da isolato singolo B cellule⁵. Essa si basa su un ottimizzato unicellulare Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) per l’amplificazione di entrambi i pesanti – e della luce-catena codifica segmenti da una singola cellula B ordinata. Questo è seguito dalla clonazione e l’espressione di questi segmenti in un sistema di espressione eucariotico, permettendo così la ricostruzione di un mAb pienamente umana. Questo protocollo è stato usato con successo a partire da cellule B da donatori vaccinati. Le cellule sono state raccolte diverse settimane dopo la vaccinazione per ottenere frequenze più alte delle cellule di B dirette contro l’Ag desiderato e quindi limitare il tempo necessario per lo screening di⁶. Altri mAbs pienamente umana sono state prodotte anche da pazienti infetti da HIV⁺ (Virus dell’immunodeficienza umana)⁷ e melanoma pazienti⁸. Nonostante questi progressi, non c’è ancora nessuna procedura disponibile che permette l’isolamento di cellule B Ag-specifici indipendenti del loro fenotipo memoria o la frequenza.

La procedura descritta qui conduce all’isolamento efficiente ex vivo di cellule B circolanti umane basato sulla loro specificità BCR, seguita dalla produzione di pienamente umano mAbs antigene-specifiche nell’alto rendimento e con un tempo di proiezione bassa. Il metodo non è limitato a cellule B memoria o cellule B disecrezione indotte dopo una risposta immunitaria, ma può essere applicato anche al repertorio delle cellule di B ingenui umano. Che funziona anche a partire da cellule B Ag-specifici presenti a frequenze molto basse è una buona indicazione della relativa efficienza. Il principio del metodo è come segue: le cellule mononucleari di sangue periferico (PBMC) sono macchiati con due tetrameri che presentano l’antigene di interesse, ognuno etichettato con un fluorocromo diverso (ad es., ficoeritrina (PE) e Allophycocyanin (APC)), e un terzo tetramero presentando un antigene strettamente correlato coniugato con un fluorocromo terzo (ad es., Brillant Violet 421 (BV421)). Per arricchire per le cellule antigene-legante, le cellule sono poi incubate con perline rivestite con anti-PE e Abs anti-APC e ordinati in colonne di separazione delle cellule. La frazione di cellule APC PE^{+ +} è selezionata, macchiato con una varietà di anticorpi specifici per diversi tipi di cellule PBMC permettere l’identificazione delle cellule di B e sottoposto al flusso cytometry ordinamento delle cellule. Cellule di B che sono PE⁺ e APC⁺, ma brillante viola^–, sono isolate. Questo passaggio Counter-seleziona le celle che non sono le cellule B o non legarsi all’antigene tetramerized, ma associa al PE o APC (queste cellule saranno PE⁺ APC^– o PE^– APC⁺) o la parte non-antigene dei tetrameri utilizzato (questi le cellule saranno BV421⁺). Le cellule B non altamente specifiche per l’epitopo di interesse Counter-vengono selezionate anche in questa fase (queste cellule saranno anche BV421⁺). Pertanto, questo metodo può purificare altamente specifici linfociti B che esprimono recettori di cellule B (BCR) in grado di discriminare tra due antigeni molto strettamente correlati. Cellule B specifiche singole sono raccolti in provette e loro PCR-amplificato Ig cDNA (acidi desossiribonucleico complementari) clonato ed espresso da una linea cellulare umana come secrete IgG anticorpi monoclonali.

Come un proof of concept, questo studio descrive la generazione efficiente di mAbs umano, che riconosce un peptide ha presentato da una classe di complesso maggiore di istocompatibilità (MHC-I) molecola e in grado di discriminare tra questo peptide e altri peptidi caricati sullo stesso MHC-I allele. Anche se il livello di complessità di questa Ag è importante, questo metodo (i) permette il recupero di ad alto rendimento di Marazzi Ag-specifici; (ii) la produzione di anticorpi monoclonali in grado di discriminare tra due strutturalmente chiudere Ags. Questo approccio può essere esteso ai pazienti vaccinati o infetti senza alcuna modifica del protocollo e ha anche già stato implementato con successo in un ratto umanizzata sistema⁹. Quindi, questo studio descrive un approccio versatile ed efficiente per generare mAbs pienamente umano che può essere utilizzato nella ricerca di base e l’immunoterapia.

Protocol

Tutti i campioni di sangue periferico umano sono stati ottenuti da donatori anonimi adulti dopo consenso informato, secondo il comitato etico locale (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedura accoppiatore NTS-2016-08). 1. isolamento delle cellule mononucleari del sangue periferico umano Nota: Il materiale di partenza può essere totale del sangue periferico umano o Citaferesi campioni. Campioni non devono essere più vecchi di 8 h e completati con antico…

Representative Results

A partire da PBMC da donatori sani, questo project presenta la generazione di anticorpi monoclonali umani, che riconoscono il peptide Pp65495 (Pp65, da citomegalovirus umano) presentata dalla classe complesso maggiore di istocompatibilità I (MHC-I) molecola HLA – A * 0201 ( HLA-A2). Questi anticorpi monoclonali in grado di discriminare tra questo complesso e complessi che rappresentano altri peptidi caricati su stesso MHC-ho molecola. <p class="jove_content" fo:keep-togeth…

Discussion

Il protocollo proposto è un metodo potente per la generazione di anticorpi monoclonali umani direttamente dalle cellule di B di Ag-specifici circolanti nel sangue. Essa combina tre importanti aspetti: (i) l’uso di un arricchimento magnetico tetramero-collegato, che permette un isolamento ex vivo di cellule B Ag-associazione anche rare; (ii) una strategia di gating che utilizza tre tetrameri di Ag (due più rilevanti e irrilevanti uno) etichettati con tre diversi fluorocromi per isolare, mediante citometria a fl…

Materials

HEK 293A cell line	Thermo Fisher scientific	R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)	Gibco by life technologies	31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)	PAA	K45-001
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4	Ambion	AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8	Invitrogen by Life Technologies	15575-020
Fetal Bovine serum (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Ficoll – lymphocytes separation medium	EuroBio	CMSMSL01-01	density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate	Invitrogen by Life Technologies	S21388	premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate	Invitrogen by thermoFisher scientific	S32362	1mg/ml 2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin	Biolegend	405225	conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor	Miltenyi Biotec	130-042-302/130-090-976
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
CD3 BV510 BD horizon	BD Pharmingen / BD Biosciences	563109	Used dilution 1:20
CD19 FITC	BD Pharmingen / BD Biosciences	345788	Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	561116	Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	338440	Used dilution 1:50
7AAD	BD Pharmingen / BD Biosciences	51-68981E (559925)	Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer	BD Biosciences
8-strip PCR tubes	Axygen	321-10-061
Racks for 96 microtubes	Dominique Dutscher	45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)	Invitrogen by thermoFisher scientific	10777-019	qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free	Gibco	10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer	New England BioLabs	S1316S	5.0 A260unit
Random hexamers	Invitrogen by thermoFisher scientific	N8080127	qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen by thermoFisher scientific	18080-044	qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
dNTP Set, Molecular biology grade	Thermo Scientific	R0182	4*100umol
5LVH1	Eurofins	ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH3	Eurofins	AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVL4_6	Eurofins	CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH5	Eurofins	CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
3HuIgG_const_anti	Eurofins	TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1	Eurofins	GGGAATTCTCACA GGAGACGA	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
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5AgeIVH1_24	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
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5AgeIVH6_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
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3SalIJH3	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
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5'LVk3	Eurofins	CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
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3'Ck543_566	Eurofins	GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
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5'AgeIVk1_9_1–13	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
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3'BsiWIJk5	Eurofins	GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'LVl1	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
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5'LVl3	Eurofins	GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5	Eurofins	GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl6	Eurofins	GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl7	Eurofins	GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5LVl8	Eurofins	GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
3'Cl	Eurofins	CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
3'XhoICl	Eurofins	CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense	Eurofins	GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC	Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade	MP Bio	AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate	Macherey Nagel	743.100.100
Enzyme Age I HF	New England Biolabs	R3552L	20000U/ml
Enzyme SalI HF	New England Biolabs	R3138L	20000U/ml
Enzyme Xho I	New England Biolabs	R0146L	20000U/ml
Enzyme BSIWI	New England Biolabs	R0553L	10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase	Invitrogen by thermoFisher scientific	15224.017	100U (1U/ul)
2X YT medium	Sigma Aldrich	Y1003-500ML
Ampicillin	Sigma Aldrich	10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification	Macherey Nagel	740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent	PolyPlus	101-40
Flat bottom96-well plate	Falcon	353072
V-bottom 96-well plate	Nunc/Thermofisher	055142
Nunc easy 175 cm2 flasks	Nunc/Thermofisher	12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer	eBiosciences	00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates	Nunc/Thermofisher	44-2404-21	high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP)	BD Pharmingen / BD Biosciences	55788
TMB substrate	BD Biosciences	555214
Streptavidin	Sigma	S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column	GE Healthcare	17-0402-01
ÄKTA FPLC	GE Healthcare	18190026
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System	BioRad	7880003