Een Protocol voor Decellularizing muis Cochleae voor binnenoor Tissue Engineering
Summary
Het doel van dit protocol is om aan te tonen van een effectieve methode om decellularize en decalcify van muis cochleae voor gebruik als steigers voor weefsel waterbouwkundige toepassingen.
Abstract
In zoogdieren, mechanosensory haarcellen die hoorzitting ontbreken de capaciteit om te regenereren vergemakkelijken, heeft die behandelingen voor gehoorverlies beperkt. Huidige regeneratieve geneeskunde strategieën hebben gericht op het transplanteren van stamcellen of genetische manipulatie van de omringende cellen van de steun in het binnenoor ter bevordering van de vervanging van beschadigde stamcellen te corrigeren van gehoorverlies. Echter de extracellulaire matrix (ECM) kan spelen een vitale rol in induceren en onderhouden van de functie van haarcellen, en is niet goed onderzocht. Met behulp van het cochleair kunnen ECM als een steiger te groeien van adulte stamcellen unieke inzichten in hoe de samenstelling en architectuur van de extracellulaire omgeving helpt cellen in stand te houden hoorzitting functie. Hier presenteren we een methode voor het isoleren en decellularizing cochleae van muizen te gebruiken als steigers adulte stamcellen geperfundeerd accepteren. In het huidige protocol zijn cochleae geïsoleerd uit euthanized muizen, decellularized en vastgelegde ontkalkte. Menselijke Wharton de gelei cellen (hWJCs) die geïsoleerd uit de navelstreng werden werden daarna zorgvuldig geperfundeerd in elke slakkenhuis. De cochleae werden gebruikt als bioreactoren en cellen werden gekweekt voor 30 dagen vóór de ondergaan verwerking voor analyse. Decellularized cochleae identificeerbare extracellulaire structuren behouden, maar deed niet onthullen de aanwezigheid van cellen of merkbaar fragmenten van DNA. Cellen in het slakkenhuis geperfundeerd grootste deel van het interieur en exterieur van het slakkenhuis binnengevallen en groeide zonder incidenten over een duur van 30 dagen. Aldus, is de huidige methode kan worden gebruikt om te bestuderen hoe cochleaire ECM beïnvloedt cel ontwikkeling en gedrag.
Introduction
Het slakkenhuis is een ingewikkelde spiraalstructuur gevonden in de temporale bot. Het bestaat uit een buitenste benige labyrint en een concentrische, innerlijke membranous labyrint1. Het labyrint van de membranous bestaat uit drie vloeistof ruimtes: Scala vestibuli, Scala media en Scala pauken1. Het scala media herbergt de sensorische epitheel, die is samengesteld uit een veelheid van celtypes, maar de zintuiglijke haarcellen (HC), die transduce mechanische energie in geluidsgolven naar zenuwimpulsen2, zijn van bijzonder belang. Blootstelling aan akoestische trauma3,4,5, medicatie6,87,ziekte en veroudering9 kan al leiden tot verminderde auditieve functie via HC dood. Haarcel verlies bij zoogdieren is definitief, in tegenstelling tot aviaire HCs, die na letsel10kunnen regenereren.
Een verscheidenheid aan hedendaagse onderzoeksinspanningen hebben geprobeerd om te herstellen van verloren HCs, hoewel de specifieke experimentele benaderingen verschillen. Manipulatie van genexpressie in de sensorische epitheel en implantatie van stamcellen gedifferentieerde buiten het lichaam zijn dominante benaderingen in het veld, hoewel inductie methoden die willen onderscheiden van stamcellen in cochleaire organoids geweest 11,12,13geprobeerd. Elk van deze benaderingen is hetzij afhankelijk direct stamcellen, of de ontwikkelingstoxiciteit signalen gebruikt door stamcellen; echter een tweede gedeeld en potentieel kritisch element is de ECM van het slakkenhuis zelf14,15.
De ECM levert niet alleen fysieke ondersteuning voor cellen en weefsels, waaronder een oppervlak voor cel adhesie, proliferatie, overleving en migratie, maar speelt ook een belangrijke rol in de ontwikkeling van HCs en de spiraal ganglion15,16 ,17. Natuurlijk geeft voorkomende ECM inductieve signalen die cel fenotype vastberadenheid en/of cel adhesie, verspreiding en overleving18 begeleiden kunnen. Bijgevolg is het gebruik van decellularized slakkenhuis in combinatie met gekweekte hWJCs bieden een unieke kans om te verkennen van de rol van de ECM en HC regeneratie. HWJCs zijn een gemakkelijk beschikbaar, niet-controversiële celtype van menselijke umbilical koorden die zich als mesenchymale stamcellen19 gedragengeïsoleerd. HWJCs hebben de mogelijkheid om te differentiëren naar beneden hormoonfuncties cel lineages20,21aangetoond. Dus, het huidige protocol detailleert de isolatie, decellularization en perfusie van cochleae van C57BL muis karkassen met hWJCs voor weefselengineering binnenoor.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben succesvol gebleken dat inheemse cochleair cellen van het slakkenhuis via een proces van decellularization, die het mogelijk voor het gebruik van het slakkenhuis als een ingewikkelde, drie-dimensionale weefsel steiger maakt kunnen worden verwijderd. Santi et al. 15 ontwikkelde de eerste methode om decellularizing cochleae, en de volumes van vele cochleair structuren door met behulp van licht blad microscopie23nauwkeurig hebben geschat. Dergelijke vroege we…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het huidige project werd gefinancierd door de Universiteit van Kansas bewijs van Concept Fonds. Wij wil bedanken het verplegend personeel op KUMC (Kansas City, KS) voor ons te helpen bij het verkrijgen van menselijke umbilical snoeren, en David Jorgensen voor het assisteren met cochleae culturen.
Materials
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
Riferimenti
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
- LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
- Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
- Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
- Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
- Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
- Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere’s disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
- House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
- Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
- Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
- Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
- Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
- Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
- Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
- Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton’s Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
- Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton’s jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
- Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton’s Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
- Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
- Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
- Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).
