Ein Protokoll für einem Maus Cochleae für das Innenohr Tissue Engineering
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist eine effektive Methode, um decellularize und Entkalken Maus Cochleae zur Nutzung als Gerüste für Tissue-engineering-Anwendungen zu demonstrieren.
Abstract
Bei Säugetieren, Mechanosensory Haarzellen, die Anhörung fehlt die Fähigkeit zu regenerieren, zu erleichtern hat die Behandlungen für Hörverlust beschränkt. Aktuelle Strategien der regenerativen Medizin konzentrierten sich auf die Transplantation von Stammzellen oder genetische Manipulation der umliegenden Stützzellen im Innenohr zu ermutigen, Ersatz der beschädigten Zellen, Verlust der Hörfähigkeit zu korrigieren. Doch die extrazelluläre Matrix (ECM) kann spielen eine entscheidende Rolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung der Funktion der Haarzellen und nicht gut untersucht. Mit dem Cochlea-können ECM als Gerüst zu adulten Stammzellen wachsen einzigartige Einblicke in wie die Zusammensetzung und die Architektur der extrazellulären Umgebung aids Zellen bei der Aufrechterhaltung des Gehörs. Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung und einem Cochleae von Mäusen, als Gerüste akzeptieren perfundierten adulten Stammzellen zu verwenden. In dem aktuellen Protokoll sind Cochleae isoliert euthanasierten Mäuse, decellularized und entkalkt. Danach wurden menschliche Wharton Gelee Zellen (hWJCs), die aus der Nabelschnur isoliert wurden sorgfältig in jedem Cochlea durchblutet. Die Cochleae dienten als Bioreaktoren, und Zellen waren für 30 Tage vor einer Bearbeitung für die Analyse kultiviert. Decellularized Cochleae identifizierbare extrazelluläre Strukturen beibehalten, aber das Vorhandensein von Zellen oder spürbare Fragmente von DNA nicht offenbart. Zellen in die Cochlea durchblutet erobert die meisten von Interieur und Exterieur der Cochlea und wuchs ohne Zwischenfall über eine Dauer von 30 Tagen. So kann die aktuelle Methode verwendet werden, wie Cochlea-ECM Affekte Zellentwicklung und Verhalten zu studieren.
Introduction
Die Cochlea ist eine komplizierte Spiralstruktur in das Felsenbein gefunden. Es besteht aus einem äußeren knöchernen Labyrinth und eine konzentrische, innere Membranous Labyrinth1. Die Membranous Labyrinth besteht aus drei fließende Räume: Scala Vestibuli, Scala Media und Scala Pauke1. Die Scala Media beherbergt das sensorische Epithel, die aus einer Vielzahl von Zelltypen besteht, aber die sensorischen Haarzellen (HC), die mechanischen Energie in Schallwellen in Nervenimpulse2transduzieren, von besonderem Interesse sind. Belastung durch Knalltrauma3,4,5, Medikamente6, Krankheit7,8und Altern9 kann alle Beeinträchtigung der auditiven Funktion über HC Tod führen. Haarzelle Verlust bei Säugetieren ist dauerhaft, im Gegensatz zu Vogelgrippe HCs, die nach Verletzungen10regenerieren können.
Eine Vielzahl von zeitgenössischen Forschungsbemühungen haben versucht, Wiederherstellen von verlorenen HCs, obwohl die spezifische experimentelle Ansätze variieren. Manipulation der gen-Expression in den sensorischen Epithel und Implantation von Stammzellen differenzierte außerhalb des Körpers sind dominante Ansätze im Bereich, obwohl Induktion Methoden, die darauf abzielen, Stammzellen in Cochlea Organellen zu unterscheiden gewesen 11,12,13versucht. Jeder dieser Ansätze ist entweder direkt auf Stammzellen oder die Entwicklungsstörungen Cues verwendet durch Stammzellen; jedoch eine zweite geteilt und potenziell kritische Element ist das ECM der Cochlea selbst14,15.
ECM bietet nicht nur physische Unterstützung für Zellen und Gewebe, die eine Oberfläche für die Zelladhäsion, Proliferation, überleben und Migration, aber auch spielt entscheidende Rolle bei der Entwicklung der HCs und die Spirale Ganglion15,16 ,17. Natürlich bietet vorkommende ECM induktive Signale, die Zelle Phänotyp Entschlossenheit und/oder Zelle Adhäsion, Vermehrung und überleben18führen können. Daher die Verwendung von decellularized Cochlea in Kombination mit kultivierten hWJCs bieten eine einmalige Gelegenheit, die Rolle der ECM und HC Regeneration zu erforschen. HWJCs sind eine schnell verfügbare, unumstrittenen Zelltyp abseits der menschlichen Nabelschnur, die Verhalten sich wie mesenchymalen Stammzellen19. HWJCs haben die Fähigkeit zu differenzieren, neurosensorische Zelle Linien20,21gezeigt. So beschreibt das aktuelle Protokoll der Isolation, Decellularization und Durchblutung des Cochleae von C57BL Maus Kadaver mit hWJCs für das Innenohr Tissue Engineering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben erfolgreich gezeigt, dass native Cochlea-Zellen aus der Cochlea über einen Decellularization-Prozess entfernt werden können, ermöglicht die Verwendung der Cochlea als eine komplizierte, dreidimensionale Gewebe-Gerüst. Santi Et Al. 15 die erste Methode für einem Cochleae entwickelt und haben genau die Volumen der durch viele Cochlea-Strukturen mit Hilfe von leichten Merkblatt Mikroskopie23geschätzt. Diese frühen Arbeiten war eine starke Basis für d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das aktuelle Projekt wurde von der University of Kansas Beweis des Konzept-Fonds finanziert. Wir möchte das Pflegepersonal an KUMC (Kansas City, KS) unterstützen uns bei der Beschaffung von menschlichen Nabelschnur und David Jorgensen mit Cochleae Kulturen zu unterstützen.
Materials
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
Riferimenti
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
- LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
- Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
- Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
- Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
- Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
- Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere’s disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
- House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
- Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
- Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
- Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
- Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
- Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
- Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
- Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton’s Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
- Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton’s jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
- Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton’s Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
- Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
- Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
- Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).
