En protokoll for Decellularizing musen Cochleae indre øret Tissue engineering
Summary
Målet med denne protokollen er å demonstrere en effektiv metode for å decellularize og avkalke mus cochleae for utnyttelse som stillaser for tissue engineering programmer.
Abstract
I pattedyr, mechanosensory hårcellene som letter høring manglende evne til å regenerere, som har begrenset behandlinger for hørselstap. Gjeldende regenerativ medisin strategier har fokusert på transplanting stamceller eller genetisk manipulering av omkringliggende støtte celler i det indre øret å oppmuntre utskifting av skadet stamceller rette hørselstap. Likevel, den ekstracellulære matrisen (EFM) kan spille en viktig rolle i inducing og vedlikeholde funksjon av hårcellene, og har ikke blitt godt undersøkt. Ved hjelp av cochlea kan ECM som en stillaset å vokse voksne stamceller tilby unik innsikt i hvordan sammensetning og arkitektur i miljøet som ekstracellulære hjelpemidler celler i opprettholde høring-funksjonen. Her presenterer vi en metode for å isolere og decellularizing cochleae fra mus til bruk som stillaser akseptere perfused voksne stamceller. I gjeldende protokollen er cochleae isolert fra euthanized mus, decellularized og decalcified. Etterpå var menneskelige Wharton gelé celler (hWJCs) som ble isolert fra navlestrengen nøye parfyme i hver sneglehuset. Cochleae ble brukt som bioreaktorer og celler ble kultivert for 30 dager før under behandling for analyse. Decellularized cochleae beholdt identifiserbar stamtre, men avsløre ikke tilstedeværelsen av celler eller merkbar fragmenter av DNA. Celler parfyme i sneglehuset invaderte de fleste interiør og eksteriør av sneglehuset og vokste uten hendelsen over en varighet på 30 dager. Dermed kan det aktuelle metoden brukes til å studere hvordan cochlear ECM påvirker celle utvikling og atferd.
Introduction
Sneglehuset er en intrikat spiral struktur funnet i temporal benet. Det består av en ytre benete labyrinten og konsentriske, indre membranous labyrint1. Membranous labyrinten består av tre flytende områder: Scala vestibuli, Scala media og Scala Pauker1. Scala media huser sensoriske epitel, som består av en rekke celletyper, men sensoriske hårcellene (HC), som transduce mekanisk energi i lydbølger til nerveimpulser2, er av spesiell interesse. Eksponering for akustisk traumer3,4,5, medisinering6, sykdom7,8og aldring9 kan alle føre svekket auditiv funksjon via HC død. Hair celle tap i pattedyr er permanent, i motsetning til avian HCs, noe som kan regenerere etter skade10.
En rekke moderne forskningsinnsats har søkt å gjenopprette tapt HCs, selv om de spesifikke eksperimentelle tilnærmingene variere. Manipulasjon av genuttrykk i Sensorisk epitel og implantering av stamceller differensiert utenfor kroppen er dominerende tilnærminger i feltet selv om induksjon metoder som søker å differensiere stamceller i cochlea organoids har vært forsøkt11,12,13. Hver av disse metodene er avhengig på stamceller, eller utviklingsmessige signaler brukes av stamceller; men andre delte, og potensielt avgjørende element er ECM av sneglehuset selv14,15.
ECM gir ikke bare fysisk støtte for celler og vev, som inkluderer en overflate for celle vedheft, spredning, overlevelse og migrasjon, men spiller også avgjørende roller i utviklingen av HCs og spiral ganglion15,16 ,17. Naturlig gir forekommende ECM induktiv signaler som kan veilede celle fenotypen besluttsomhet og/eller celle vedheft, spredning og overlevelse18. Derfor bruk av decellularized sneglehuset i kombinasjon med kulturperler hWJCs tilbyr en unik mulighet til å utforske rollen ECM og HC fornyelse. HWJCs er en lett tilgjengelig, ikke-kontroversielt celle type isolert fra menneskelige navle ledninger som oppfører seg som mesenchymal stamceller19. HWJCs har vist evnen til å skille ned neurosensory celle overleveringslinjer20,21. Dermed detaljer gjeldende protokollen isolasjon, decellularization, og perfusjon av cochleae fra C57BL musen skrotter med hWJCs indre øret tissue engineering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har vist at innfødt cochlea celler kan fjernes fra sneglehuset via en decellularization prosess, som tillater bruk av sneglehuset som en intrikate, tredimensjonale vev stillaset. Santi et al. 15 utviklet den første metoden for decellularizing cochleae, og har nøyaktig anslått volum av mange cochlea strukturer gjennom ved hjelp av lys ark mikroskopi23. Slik tidlige arbeid var et sterkt grunnlag for tissue engineering og celle kultur teknikker som presenteres …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det gjeldende prosjektet ble finansiert ved University of Kansas bevis på konseptet fondet. Vi ønsker å takke pleiepersonalet KUMC (Kansas City, KS) for å hjelpe oss å skaffe menneskelige kontrollkabler og David Jørgensen bistå med cochleae kulturer.
Materials
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
Riferimenti
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
- LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
- Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
- Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
- Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
- Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
- Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere’s disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
- House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
- Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
- Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
- Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
- Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
- Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
- Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
- Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton’s Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
- Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton’s jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
- Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton’s Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
- Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
- Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
- Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).
