Fare Cochleae iç kulak doku mühendisliği için Decellularizing için bir iletişim kuralı
Summary
Bu iletişim kuralının amacı decellularize ve fare cochleae doku mühendisliği uygulamaları için iskele olarak kullanımı için decalcify için etkili bir yöntem göstermektir.
Abstract
Memelilerde, işitme eksikliği yeniden yeteneği kolaylaştırmak mechanosensory saç hücreleri olan işitme kaybı için tedavi sınırlıdır. Geçerli rejeneratif tıp stratejileri kök hücre veya destek hücreleri değiştirme hasarlı kök hücrelerin işitme kaybı düzeltmek için teşvik etmek için iç kulak çevresindeki genetik manipülasyon nakli üzerinde odaklanmıştır. Henüz, hücre dışı Matriks (ECM) inducing ve saç hücreleri işlevini sürdürmek hayati bir rol oynayabilir ve değil de soruşturma. Koklear kullanarak nasıl kompozisyon ve ekstraselüler ortamın mimari AIDS hücreleri işitme fonksiyonu sürdürülmesi içine benzersiz anlayışlar ECM bir iskele olarak erişkin kök hücreleri büyümeye sağlayabilir. Burada izole ve cochleae üzerinden periosteum erişkin kök hücreleri kabul iskele kullanmak için fare decellularizing bir yöntem mevcut. Geçerli protokol cochleae decellularized ve decalcified euthanized fare, izole edilmiştir. Daha sonra göbek kordonu izole edildi insan Wharton’ın jöle hücreleri (hWJCs) dikkatle her koklea derin. Cochleae Biyoreaktörler kullanıldı ve analiz için işleme geçiren 30 gün için hücreler kültürlü. Decellularized cochleae olarak tanımlanabilir hücre dışı yapılar korunur ama hücrelerin varlığı veya DNA’ın dikkat çeken parçaları olmadığını göstermiştir. Koklea derin hücreler içte ve dışta koklea çoğunu işgal ve olay olmadan 30 gün süre içinde büyüdü. Böylece, geçerli yöntemi nasıl koklear ECM etkiler hücre gelişimi ve davranış çalışma için kullanılabilir.
Introduction
Koklea temporal kemik bulundu bir karmaşık sarmal yapısıdır. Bir dış kemik labirent ve konsantrik, iç membranöz labirentin1oluşur. Membranöz labirentin üç sıvı boşluk oluşur: Scala vestibuli, Scala medya ve Scala tympani1. Çok sayıda hücre tiplerinin oluşmaktadır, duyu epiteli scala medya evler ama duyusal saç ses dalgaları sinir uyarılarının2mekanik enerji transduce, hücreleri (HC), belirli ilgi vardır. Akustik travma3,4,5, ilaç6, hastalık7,8ve yaşlanma9 maruz tüm Engelli işitsel işlevi HC ölüm ile sonuçlanabilir. Memelilerde saç hücre kaybı kalıcı yaralanma10‘ dan sonra yeniden oluşturabilirsiniz kuş HCs aksine.
Çağdaş araştırma çabalarının çeşitli çalışmışlardır kayıp HCs, geri yüklemek belirli deneysel yaklaşımlar farklılık. Duyu epiteli gen ifadesinde manipülasyon ve vücut dışında farklı kök hücre implantasyonu baskın yaklaşım alanında, kök hücre koklear organoids ayırt etmeye indüksiyon yöntemleri olmasına rağmen vardır 11,12,13çalıştı. Her bu yaklaşımların olması güvenen doğrudan kök hücre veya kök hücreleri tarafından; kullanılan gelişimsel ipuçları Ancak, bir saniye paylaşılan ve potansiyel olarak kritik koklea kendisi ECM öğedir14,15.
ECM sadece fiziksel için hücre ve doku, hücre adezyon, nükleer silahların yayılmasına karşı hayatta kalma ve geçiş için bir yüzey içerir, ancak aynı zamanda HCs ve sarmal ganglion15,16 gelişiminde önemli roller oynar destekler ,17. Doğal olarak meydana gelen ECM hücre fenotip belirlenmesi ve/veya hücre adezyon, yayılmasını önleme ve hayatta kalma18rehberlik endüktif sinyalleri sağlar. Sonuç olarak, kültürlü hWJCs ile birlikte decellularized koklea kullanımı ECM ve HC rejenerasyon rol keşfetmek için eşsiz bir fırsat sunuyoruz. HWJCs Mezenkimal Kök hücre19gibi davranan insan göbek bağları gelen izole bir hazır, tartışmalı olmayan hücre türü vardır. HWJCs neurosensory hücre soy20,21ayırt etmek için yetenek göstermiştir. Böylece, geçerli protokol izolasyon, decellularization ve cochleae C57BL fare leşleri ile iç kulak doku mühendisliği için hWJCs dan perfüzyon ayrıntıları.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yerel koklear hücreleri koklea koklea bir karmaşık, üç boyutlu doku iskele olarak kullanmak için izin verir bir decellularization süreci ile gelen kaldırılabilmesi için başarılı bir şekilde göstermiştir. Santi ve ark. 15 decellularizing cochleae için ilk yöntem geliştirdi ve birçok koklear yapıları birimleri hafif levha mikroskobu23yardımı ile doğru bir şekilde tahmin. Böyle erken dönem çalışmaları doku Mühendisliği ve burada sunul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geçerli proje kavramı Fonu University of Kansas kanıtı tarafından finanse edildi. Biz bize cochleae kültürleri ile yardım için insan göbek bağları ve David Jorgensen elde yardımcı olmak için KUMC (Kansas City, KS) hemşirelerin teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
Riferimenti
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
- LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
- Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
- Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
- Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
- Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
- Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere’s disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
- House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
- Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
- Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
- Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
- Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
- Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
- Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
- Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton’s Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
- Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton’s jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
- Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton’s Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
- Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
- Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
- Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).
