استخدام جهاز ميكروفلويديكس لتحفيز الميكانيكية وتصوير قرار عالية من C. ايليجانس
Summary
أدوات جديدة للبحوث ميتشانوبيولوجي هناك حاجة لفهم كيف الميكانيكية الإجهاد ينشط المسارات البيوكيميائية ويتسبب الاستجابات البيولوجية. هنا، نحن عرض طريقة جديدة لتحفيز الميكانيكية الانتقائي للحيوانات المعطل تداولها مع فخ موائع جزيئية السماح بتصوير عالي الدقة من الاستجابات الخلوية.
Abstract
هدف مركزي واحد من ميتشانوبيولوجي فهم متبادل أثر الإجهاد الميكانيكي على البروتينات والخلايا. على الرغم من أهميته، هو ما زالت غير مفهومة تأثير الإجهاد الميكانيكي على وظيفة الخلوية. في جزء منه، وجود هذه الفجوة في المعرفة نظراً لعدد قليل من أدوات تمكين تشوه المتزامن للأنسجة والخلايا، وتصوير الأنشطة الخلوية في الحيوانات الحية، وكفاءة تقييد الحركة في الكائنات نموذج خلاف كثيري التنقل، مثل ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس. صغر حجم C. ايليجانس يجعلها مباراة ممتازة للأجهزة المستندة إلى ميكروفلويديكس للبحث، وقد عرضت حلولاً للتثبيت باستخدام أجهزة موائع جزيئية. على الرغم من أن هذه الأجهزة تسمح لتصوير عالي الدقة، هو المغطى الحيوان كاملا في بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، والزجاج، ويحد من الوصول الفعلي لتسليم القوة الميكانيكية أو التسجيلات الكهربية. في الآونة الأخيرة، قمنا بإنشاء جهاز يدمج المحركات الهوائية مع تصميم ملائمة متوافق مع الفحص المجهري الفلورية ذات الدقة العالية. قناة يشتغل مفصولة من القناة الملائمة دودة غشاء PDMS رقيقة. هو نحيد هذا الحاجز إلى الجانب من دودة بتطبيق ضغط من مصدر خارجي. الجهاز يمكن استهداف الخلايا العصبية ميتشانوسينسيتيفي الفردية. تنشيط هذه الخلايا العصبية يتم تصويرها في الاستبانة مع مؤشرات الكالسيوم المرمزة وراثيا. تقدم هذه المقالة طريقة عامة استخدام سلالات C. ايليجانس معربا عن مؤشر النشاط المراعية للكالسيوم (GCaMP6s) في هذه الخلايا العصبية مستقبلات اللمس (ترنس). ومع ذلك، الأسلوب، لا يقتصر ترنس ولا أجهزة استشعار الكالسيوم كتحقيق، بل يمكن توسيعها للخلايا الحساسة ميكانيكيا أو أجهزة استشعار أخرى.
Introduction
حاسة اللمس توفر الحيوانات مع معلومات حاسمة عن بيئتهم. ويعتبر اللمس اعتماداً على القوة التطبيقية، حميدة، ممتعة، أو مؤلمة. تم الكشف عن تشوه النسيج خلال اتصال بالخلايا ميتشانوريسيبتور المتخصصة جزءا لا يتجزأ من الجلد التي تعبر عن البروتينات مستقبلات، قنوات أيون الأكثر شيوعاً. خطوات ربط مفهوم القوة بايون قناة التنشيط خلال اللمس والألم ليست مفهومة تماما. ومن المعروف حتى أقل حول كيف فلاتر تشوه الميكانيكية وميتشانوريسيبتورس ما إذا كان الكشف عن تغييرات في إجهاد أنسجة الجلد أو التشديد على1،،من23. وتنشأ هذه الفجوة في التفاهم، في جزء منه، من الافتقار إلى الأدوات المناسبة لتطبيق التحفيز الميكانيكية الدقيقة على سطح الجلد من الحيوانات الحية حين رصد الاستجابات على المستوى الخلوي. بينما مجهر القوة الذرية وقد استخدمت على نطاق واسع لتطبيق وقياس القوى في الخلايا المعزولة4،5 ، وأيضا لتنشيط مستقبلات Piezo1 في المعيشة الخلايا6، تجارب مماثلة باستخدام الحيوانات الحية، وخاصة C. ايليجانس، كان التحدي المعروف بسبب الحركة الجوهرية لهذا الموضوع. تقليديا يتم التحايل على هذا التحدي باستخدام الغراء cyanoacrylate الصف البيطرية أو الجراحية لشل الحيوانات الفردية في أجار منصات1،7،،من89. وهذا النهج قد تم منتجة، لكن القيود المتصلة بالمهارات المطلوبة للتثبيت بالالتصاق والسطح أجار الناعمة على الامتثال الميكانيكية. استراتيجية ميكروفلويديكس هو بديل مجاني أن يتجنب بعض المضاعفات المرتبطة بالالتصاق.
ديدان أسطوانية C. ايليجانس هو كائن نموذج وراثية مع نظام عصبي معين تماما أنه، نظراً لحجم الحيوان، يكون مناسباً للتكنولوجيا ميكروفلويديكس. عرض الأجهزة المستندة إلى ميكروفلويديكس وميزة أن الحيوانات خلاف ذلك الغاية متنقلة يمكن ضبط النفس أثناء إجراء تصوير عالي الدقة والتسليم من المحفزات العصبية مودولاتوري ذات الصلة. مع المساعدة من موائع جزيئية يمكن معطلة التكنولوجيات، تعيش الحيوانات دون ضرر10،11، مما يتيح رصد النشاط السلوكية على مدى ال12،عمر كامل13 وعالية الدقة تصوير نشاط الخلايا العصبية14،15،،من1617. علاوة على ذلك، العديد من الخلايا العصبية ميتشانوريسيبتور اللازمة للاحساس باللمس والألم يمكن أن تتسم بها الفسيولوجية1،8، الميكانيكية4،،من1819، والجزيئية مستوى20،،من2122.
C. ايليجانس الحواس لطيف المنبهات الميكانيكية لجدار الجسم باستخدام ترنس ستة، ثلاثة منها يعصب للحيوان الأمامي (المل/R، والألغام المضادة للمركبات) وثلاثة منها يعصب مؤخرة الحيوان (بلمل/R و PVM). وقد درست أيون قناة الجزيئات اللازمة ترانسدوسينج قوة المطبقة في إشارة بيوكيميائية على نطاق واسع في ترنس8. تعرض هذه المقالة منصة موائع جزيئية23 التي تمكن الباحثين من تطبيق قوي ميكانيكية دقيقة على الجلد المعطل تداولها C. ايليجانس الدودة، أثناء تلاوته التشوه في الأنسجة الداخلية بالتصوير الضوئي. بالإضافة إلى تقديم محفزات ميكانيكية محددة تحديداً جيدا، يمكن تسجيلها في الخلايا العصبية ميتشانوريسيبتور مع قرار سوبسيلولار الكالسيوم العابرين ويرتبط بالخصائص المورفولوجية والتشريحية. الجهاز يتكون من قناة محاصرة المركزي الذي يحمل حيوانا واحد وتعرض الجلد إلى جانب ست قنوات يشتغل هوائية (الشكل 1 و الشكل 2). القنوات الست المتوضعة على طول القناة الملائمة لتقديم المحفزات الميكانيكية لكل من ترنس الست للدودة. يتم فصل هذه القنوات من الدائرة الملائمة أغشية PDMS رقيقة، التي يمكن أن تكون مدفوعة بمصدر ضغط جوي خارجي (الشكل 1). ونحن معايرة انحراف فيما يتعلق بالضغط وتوفير القياسات في هذه المقالة. ويمكن تناولها على حدة كل صمام والمستخدمة لتحفيز ميتشانوريسيبتور الاختيار. الضغط هو تسليم باستخدام مضخة ضغط يحركها بيزو ولكن يمكن استخدام أي جهاز بديل. نظهر أن بروتوكول ضغط يمكن استخدامها لتنشيط ترنس في فيفو وإظهار التشغيل أجهزة مناسبة لتقديم محفزات ميكانيكية للكبار C. ايليجانس، تحميل الحيوانات الكبار في الأجهزة، والقيام بتصوير الكالسيوم التجارب، وتحليل النتائج. تصنيع جهاز يتألف من خطوتين أساسيتين: 1) التصويرية لجعل العفن من سو-8؛ و 2) صب PDMS جعل جهاز. توخياً للإيجاز والوضوح، يحال القراء إلى سبق نشرها مقالات والبروتوكولات24،25 للحصول على إرشادات حول كيفية إعداد قوالب والأجهزة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول يوضح أسلوب لتقديم تحفيز ميكانيكية دقيقة لجلد الدودة المحاصرين في رقاقة موائع جزيئية. أنه يهدف إلى تسهيل اندماج المحفزات المادية للإجابة على الأسئلة البيولوجية، ويهدف إلى تنظيم عملية البحث ميتشانوبيولوجي في مختبرات بيولوجية. ويمتد هذا الأسلوب السابق فحوصات لتقييم وظيفة ا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر ساندرا نون مانوسالفاس-كينو، “لادبلي عيد البوريم”، ميمون فرح وجوبيسيتي ديفيا سانشيز فيرونيكا لتقديم الدعم في تصميم الجهاز وجيل من الحيوانات المسخ. وأيد هذا البحث بالمعاهد الوطنية للصحة منح R01EB006745 (BLP)، R01NS092099 (إلى MBG)، K99NS089942 (في الكنيست)، F31NS100318 (إلى ALN) وتلقت تمويلاً من مجلس البحوث الأوروبي (المنسق) تحت أفق 2020 للبحث والابتكار في الاتحاد الأوروبي (برنامج منح الاتفاق رقم 715243 لعضو الكنيست).
Materials
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric – imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
Riferimenti
- Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
- Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
- Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
- O’Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
- Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Li, S., Stone, H. a., Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
- Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
- Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
- Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
- Arnadóttir, J., O’Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
- Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
- Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O’hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
- Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
- Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
- Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
- Petzold, B. C., Park, S. -. J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
- Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).
- Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
- Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).
