JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Neuroscienze

Ved hjælp af en mikrofluidik anordning for mekanisk Stimulation og høj opløsning Imaging af C. elegans

Published: February 19, 2018
doi:
10.3791/56530
, , , , ,
1Department of Molecular and Cellular Physiology,Stanford University, 2Department of Mechanical Engineering,Stanford University, 3Department of Bioengineering,Stanford University, 4Group of Neurophotonics and Mechanical Systems Biology,The Institute of Photonic Sciences (ICFO)

Summary

Nye værktøjer til mechanobiology forskning er nødvendig for at forstå hvordan mekanisk stress aktiveres biokemiske veje og fremkalder biologiske svar. Her, fremvise vi en ny metode til selektiv mekaniske stimulation af immobiliserede dyr med en mikrofluid fælde så høj opløsning billeddannelse af cellulære svar.

Abstract

Et centralt mål for mechanobiology er at forstå den gensidige effekt af mekanisk stress på proteiner og celler. Trods dens betydning, er mekanisk stress indflydelse på cellulær funktion stadig dårligt forstået. Delvis eksisterer denne videnskløft fordi par værktøjer aktiverer samtidige deformation af væv og celler, billeddannelse af cellulære aktivitet i levende dyr og effektiv begrænsning af motilitet i ellers meget mobile modelorganismer, såsom nematode Caenorhabditis elegans. Den lille størrelse af C. elegans gør dem en fremragende match til enheder, mikrofluidik-baseret forskning og løsninger for immobilisering har været præsenteret ved hjælp af mikrofluid enheder. Selv om disse enheder giver mulighed for høj opløsning imaging, er dyret helt indkapslet i Polydimethylsiloxan (PDMS) og glas, begrænse fysisk adgang til levering af mekanisk kraft eller elektrofysiologiske optagelser. For nylig har skabt vi en enhed, der integrerer pneumatisk aktuatorer med en diffusering design, der er kompatibel med høj opløsning Fluorescens mikroskopi. Aktivering-kanal er adskilt fra den orm-fældefangst kanal af en tynd PDMS membran. Denne membran er afbøjet i siden af en orm ved at anvende pres fra en ekstern kilde. Enheden kan målrette individuelle mechanosensitive neuroner. Aktivering af disse neuroner er afbildet på høj opløsning med genetisk kodet calcium indikatorer. Denne artikel præsenterer den generelle metode ved hjælp af C. elegans stammer udtryk for calcium-følsomme aktivitet indikator (GCaMP6s) i deres touch receptor neuroner (TRNs). Metoden, men er ikke begrænset til TRNs eller calcium sensorer som en sonde, men kan udvides til andre mekanisk-følsomme celler eller sensorer.

Introduction

Følelse af touch giver dyr med vigtige oplysninger om deres miljø. Afhængigt af den anvendte kraft opfatter touch som harmløst, lystbetonet eller smertefuld. Væv deformation under touch er opdaget af specialiserede mechanoreceptor celler indlejret i huden, der udtrykker receptorproteiner, oftest Ionkanaler. Skridt forbinder kraft opfattelse at ion-kanal aktivering under touch og smerte er ikke fuldt forstået. Endnu mindre er kendt om hvordan hudvæv filtre mekanisk deformation og om mechanoreceptors registrerer ændringer i stamme eller stress1,2,3. Dette hul i forståelse opstår delvis fra en mangel på egnede værktøjer til at anvende præcis mekaniske stimulering til overfladen af huden af en levende dyr under iagttagelse af svarene på cellulært niveau. Mens atomic force mikroskopi er blevet brugt flittigt til at anvende og måle kræfter i isolerede celler4,5 og også aktivere Piezo1 receptorer i levende celler6, lignende forsøg med levende dyr, især C. elegans, har været notorisk udfordrende på grund af den iboende mobilitet af emnet. Denne udfordring er traditionelt omgået ved hjælp af veterinær – eller kirurgisk-grade ren lim til at immobilisere enkelte dyr på agar puder1,7,8,9. Denne tilgang har været produktive, men har begrænsninger vedrører færdigheder kræves for immobilisering af limning og bløde agar overfladen på mekaniske overholdelse. En mikrofluidik strategi er et gratis alternativ, der undgår nogle af de komplikationer knyttet til limning.

Nematode C. elegans er en organisme, genetiske model med en helt kortlagt nervesystem, der på grund af dyrets størrelse, er en god pasform for mikrofluidik teknologi. Mikrofluidik-baserede enheder tilbud den fordel, at de ellers ekstremt mobile dyr kan være tilbageholdende mens de udfører høj opløsning imaging og levering af relevante neuro-modulerende stimuli. Ved hjælp af mikrofluid kan teknologier, levende dyr være immobiliseret uden skade10,11, at aktivere overvågning af adfærdsmæssige aktivitet over hele levetid12,13 og høj opløsning Imaging af neuronal aktivitet14,15,16,17. Yderligere, mange mechanoreceptor neuroner behov for følelsen af touch og smerte kan karakteriseres på deres fysiologiske1,8, mekanisk4,18,19, og molekylære niveau20,21,22.

C. elegans sanser blid mekaniske stimuli til sin krop væg ved hjælp af seks TRNs, hvoraf tre innerverer dyrets forreste (ALML/R og AVM) og tre af innerverer dyrets posterior (PLML/R og PVM). Ion-kanal molekyler til transducing en kraft til en biokemiske signal er blevet grundigt undersøgt i sin TRNs8. Denne artikel præsenterer en mikrofluid platform23 , der gør det muligt for forskere at anvende præcis mekaniske kræfter på huden af en immobiliseret C. elegans spolorm, mens du læser ud af deformation af dens indre væv af optiske billeddannelse. Ud over fremlæggelsen veldefinerede mekaniske stimuli, kan calcium transienter registreres i mechanoreceptor neuroner med subcellulært opløsning og korreleret med anatomiske og morfologiske funktioner. Enheden består af en central fældefangst kanal, der holder et enkelt dyr og præsenterer sin hud ved siden af seks pneumatisk aktivering kanaler (figur 1 og figur 2). Seks kanaler er placeret langs diffusering kanalen til at levere mekaniske stimuli til hver af worm’s seks TRNs. Disse kanaler er adskilt fra fældefangst kammer med tynde PDMS membraner, der kan være drevet af en ydre luft tryk source (figur 1). Vi kalibreret fordrejning med hensyn til presset og giver målinger i denne artikel. Hvert aktuator kan behandles individuelt og bruges til at stimulere en mechanoreceptor valg. Trykket leveres ved hjælp af et piezo-drevet tryk pumpe, men eventuelle alternative enhed kan bruges. Vi viser, at pres-protokollen kan bruges til at aktivere TRNs i vivo og demonstrere Transporterende enheder velegnet til levere mekaniske stimuli til voksen C. elegans, indlæse voksne dyr i enheder, udfører calcium imaging eksperimenter, og analysere resultaterne. Enheden fabrikation består af to hovedtrin: 1) fotolitografi at gøre en Skimmelsvamp fra SU-8; og 2) molding PDMS for at gøre en enhed. Kortfattethed og klarhed henvises læsere til tidligere publicerede artikler og protokoller24,25 for instruktioner om, hvordan til at fremstille forme og enheder.

Protocol

1. enhed fabrikation Hent filen vedhæftet maske (supplerende fil 1) og generere en chrome maske ved hjælp af en kommerciel tjeneste eller interne facility. Som den mindste dimension på enheden er 10 µm (aktuator membran tykkelse), sikre, at masken har tilstrækkelig høj opløsning inden for ± 0,25 µm, pålideligt producere funktionerne. Følg SU-8 fotolitografi standardmetoder (f.eks.referencer24,<sup class="…

Representative Results

SU-8 litografi og Chip limningLitografi protokol og PDMS støbning følge standard procedurer. Detaljer kan findes andetsteds23,24,25,26. PDMS skulle skrælle wafer uden problemer efter hærdning. Hvis SU-8 funktioner rip off under PDMS peeling, var enten SU-8 friktion lag eller silanisering utilstrækkelig. Hvis plasma-aktivering af glas co…

Discussion

Denne protokol viser en metode til at levere præcise mekaniske stimulering til huden af en rundorm, der er fanget i en mikrofluid chip. Det er beregnet til at lette integrationen af fysiske stimuli for at besvare biologiske spørgsmål og sigter mod at strømline mechanobiology forskning i biologiske laboratorier. Denne metode udvider tidligere assays for at vurdere funktionen af mechanosensory neuroner i C. elegans. Tidligere kvantitative og semi-kvantitative teknikker målt styrker1<su…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Sandra N. Manosalvas-Kjono, Purim Ladpli, Farah Memon, Divya Gopisetty og Veronica Sanchez for støtte i enhed design og produktion af mutant dyr. Denne forskning blev støttet af NIH tilskud R01EB006745 (til BLP), R01NS092099 (til MBG), K99NS089942 (til MK), F31NS100318 (til ALN) og modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EUs Horisont 2020 forskning og innovation program () tilskudsaftale No. 715243 til MK).

Materials

Chrome mask Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chrome mask Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chrome mask Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
4'' Silicon wafer (B-test) Stanford Nanofabrication Facility
SU-8 2002 MicroChem
SU-8 2050 MicroChem
Spin-coater Laurell Technologies WS-400BZ-6NPP/LITE
Exposure timer Optical Associates, Inc OAI 150
Illumination controller Optical Associates, Inc 2105C2
SU-8 developer MicroChem
2-Propanol Fisher Scientific A426F-1GAL
Acetone Fisher Scientific A18-4
Trichloromethylsilane (TCMS) Sigma-Aldrich 92361-500ML Caution: TCMS is toxic and water-reactive
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS prepolymer
Biopsy punch, 1 mm VWR 95039-090
Oxygen Plasma Asher Branson/IPC
Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW New England Small Tube Corporation NE-1300-01
Nalgene syringe filter, 0.22 μm Thermo Scientific 725-2520 to filter all solution, small particles would clog the chip
Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID Solomon Scientific BPE-T50
Syringe, 1 ml BD Scientific 309628 for worm trapping and release
Syringe, 20 ml BD Scientific 309661 for gravity-based flow
Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump Gilson to suck solutions and worms out of the chip
Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel Elveflow OB1 MK3 pressure delivery
Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD McMaster-Carr 5195 T52 connection from house air to pressure pump
Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD McMaster-Carr 5195 T51 connect pressure pump to small tubng
Push-to-Connect Tube Fitting for Air McMaster-Carr 5111K468 metric – imperial converter
Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD McMaster-Carr 5779 K258
Leica DMI 4000 B microscopy system Leica
63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective Leica 506081
Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera Hamamatsu C11440-42U
Lumencor Spectra X light engine Lumencor With cyan and green/yellow light source
Excitation beam splitter Chroma 59022bs in the microscope
Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics Hamamatsu A12801-01 to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip
Emission beam splitter Chroma T570lpxr in the image splitter
Emission filters GCamp6s Chroma ET525/50m in the image splitter
Emission filters mCherry Chroma ET632/60m in the image splitter
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
  2. Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
  3. Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
  4. Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
  5. Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
  6. Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
  7. Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
  8. O’Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
  9. Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
  10. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
  12. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  13. Li, S., Stone, H. a., Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
  14. Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
  15. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
  16. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  17. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
  18. Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
  19. Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
  20. Arnadóttir, J., O’Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
  21. Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
  22. Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O’hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
  23. Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
  24. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
  25. Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
  26. Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
  27. Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
  28. Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  29. Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
  30. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
  31. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
  34. Petzold, B. C., Park, S. -. J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
  35. Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
  36. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  37. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  38. Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).
  39. Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
  40. Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).

Tags

MicrofluidicsMechanical StimulationHigh-resolution ImagingC. ElegansMechanobiologySensory BiologyPressure ActuatorsGCaMPRFPFluorescence MicroscopyM9 BufferPeristaltic PumpPDMS
check_url/it/56530?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans. J. Vis. Exp. (132), e56530, doi:10.3791/56530 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image