Utilizzando un dispositivo di microfluidica per stimolazione meccanica e alta risoluzione Imaging di c. elegans
Summary
Nuovi strumenti per la ricerca di mechanobiology sono necessari per capire lo stress come meccanico attiva vie biochimiche e suscita risposte biologiche. Qui, presenteremo un nuovo metodo per stimolazione meccanica selettiva degli animali immobilizzati con una trappola di microfluidica permettendo di imaging ad alta risoluzione delle risposte cellulari.
Abstract
Uno degli obiettivi centro di mechanobiology è capire l’effetto reciproco di stress meccanico sulle cellule e proteine. Nonostante la sua importanza, l’influenza dello stress meccanico sulla funzione cellulare è ancora capito male. In parte, questa lacuna di conoscenza esiste perché alcuni strumenti attivare deformazione simultanea di tessuti e cellule, imaging di attività cellulare negli animali vivi ed efficiente limitazione della motilità in organismi modello altrimenti altamente mobile, come il nematode Caenorhabditis elegans. Le piccole dimensioni di c. elegans li rendono un’eccellente corrispondenza ai dispositivi di ricerca basata su microfluidica, e soluzioni per l’immobilizzazione sono stati presentati utilizzando dispositivi microfluidici. Anche se questi dispositivi consentono l’imaging ad alta risoluzione, l’animale è completamente racchiuso in polidimetilsilossano (PDMS) e vetro, limitando l’accesso fisico per la consegna di forza meccanica o registrazioni elettrofisiologiche. Recentemente, abbiamo creato un dispositivo che integra attuatori pneumatici con un disegno di intrappolamento che è compatibile con microscopia di fluorescenza ad alta risoluzione. Il canale di azionamento è separato dal canale di registrazione di vite senza fine da una sottile membrana PDMS. Questa membrana è deviato sul fianco di un verme applicando pressione da un’origine esterna. Il dispositivo può indirizzare mechanosensitive singoli neuroni. L’attivazione di questi neuroni è ripreso in alta risoluzione con indicatori di calcio geneticamente codificato. Questo articolo presenta il metodo generale usando ceppi di c. elegans esprimendo indicatore attività calcio-sensibile (GCaMP6s) nel loro neuroni recettori di tocco (TRNs). Il metodo, tuttavia, non è limitato a TRNs né ai sensori di calcio come una sonda, ma può essere esteso ad altre cellule sensibili meccanicamente o sensori.
Introduction
Il senso del tatto fornisce animali con informazioni cruciali per il loro ambiente. A seconda della forza applicata, tocco è percepito come innocuo, piacevole o doloroso. La deformazione del tessuto durante il tocco viene rilevata da cellule specializzate Meccanocettore incorporate nella pelle che esprimono proteine recettoriali, più comunemente i canali ionici. I passaggi che collegano percezione della forza di attivazione dei canali ionici durante il tocco e il dolore completamente non sono capiti. Ancor meno è conosciuto circa come il tessuto della pelle filtri deformazione meccanica e se meccanorecettori per rilevare le modifiche nel ceppo o stress1,2,3. Questo scarto nella comprensione deriva, in parte, da una mancanza di strumenti adeguati per applicare precise stimolazioni meccaniche sulla superficie della pelle di un animale vivente osservando le risposte a livello cellulare. Considerando che la microscopia a forza atomica è stata usata estesamente per applicare e misurare le forze in cellule isolate4,5 e anche per attivare recettori Piezo1 in vita cellule6, esperimenti simili utilizzando animali viventi, soprattutto C. elegans, sono stati notoriamente impegnativo a causa della mobilità intrinseca del soggetto. Questa sfida è tradizionalmente aggirata utilizzando colla del cianoacrilato veterinaria – o -grado chirurgico per immobilizzare i singoli animali agar pastiglie1,7,8,9. Questo approccio è stato produttivo, ma ha limitazioni legate all’abilità necessaria per immobilizzazione di incollaggio e la superficie di agar molle su fattori meccanici. Una strategia di microfluidica è un’alternativa gratuita che consente di evitare alcune delle complicazioni legate a incollaggio.
Il nematode c. elegans è un organismo modello genetico con un sistema nervoso completamente mappato che, a causa delle dimensioni dell’animale, è una buona misura per la tecnologia microfluidica. Offerta di dispositivi basati su microfluidica il vantaggio che gli animali altrimenti estremamente mobili possono essere trattenuti durante l’esecuzione di imaging ad alta risoluzione e la consegna di stimoli neuro-modulatori rilevanti. Con l’aiuto di microfluidica tecnologie, animali viventi possono essere immobilizzati senza danno10,11, consentendo il monitoraggio di attività comportamentali sopra l’intero ciclo di vita12,13 e ad alta risoluzione Imaging di attività neuronale14,15,16,17. Ulteriormente, molti neuroni Meccanocettore necessari per il senso del tatto e dolore può essere caratterizzato il loro fisiologico1,8, meccanico4,18,19e molecolare livello20,21,22.
C. elegans sensi dolci stimoli meccanici alla sua parete di corpo usando sei TRNs, tre dei quali innervano l’animale anteriore (ALML/R e AVM) e tre delle quali innervano posteriore dell’animale (PLML/R e PVM). Le molecole di canale di ioni necessari per trasdurre una forza applicata in un segnale biochimico sono state studiate estesamente in suoi TRNs8. Questo articolo presenta una piattaforma di microfluidica23 che consente ai ricercatori di applicare forze meccaniche precisione sulla pelle di un immobilizzato c. elegans ascaridi, durante la lettura fuori la deformazione dei suoi tessuti interni di imaging ottico. Oltre a presentare ben definiti stimoli meccanici, transienti di calcio possono essere registrate in neuroni di Meccanocettore con risoluzione subcellulare e correlati con caratteristiche morfologiche e anatomiche. Il dispositivo è costituito da un canale centrale dell’intrappolamento che contiene un singolo animale e presenta la sua pelle accanto a sei canali di azionamento pneumatico (Figura 1 e Figura 2). I sei canali sono posizionati lungo il canale di registrazione dei colori per fornire stimoli meccanici a ciascuna delle sei TRNs del verme. Questi canali sono separati dalla camera di intrappolamento da sottili diaframmi PDMS, che possono essere azionati da una sorgente di pressione dell’aria esterna (Figura 1). Abbiamo calibrato la deviazione rispetto alla pressione e fornire le misure in questo articolo. Ogni attuatore può essere indirizzato singolarmente e usato per stimolare un Meccanocettore di scelta. La pressione viene recapitata tramite una pompa di pressione piezo-driven, ma può essere usato qualunque dispositivo alternativo. Indichiamo che il protocollo di pressione può essere utilizzato per attivare TRNs in vivo e dimostrare dispositivi di azionamento adatta per fornire stimoli meccanici per adulti di c. elegans, caricamento di animali adulti in dispositivi, esecuzione di formazione immagine del calcio esperimenti e analisi dei risultati. Fabbricazione di dispositivi è costituito da due fasi principali: 1) fotolitografia per fare uno stampo da SU-8; e 2) stampaggio PDMS per rendere un dispositivo. Per ragioni di brevità e chiarezza, i lettori sono indicati precedentemente pubblicati articoli e protocolli24,25 per istruzioni su come produrre le muffe e i dispositivi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo viene illustrato un metodo per la consegna precisa stimolazione meccanica per la pelle di un verme intrappolato in un chip microfluidico. Esso è destinato a facilitare l’integrazione di stimoli fisici per rispondere alle domande biologiche e mira a snellire mechanobiology ricerca nei laboratori biologici. Questo metodo estende precedenti saggi per valutare la funzione dei neuroni che mechanosensory in c. elegans. Tecniche quantitative e semi-quantitativa precedenti misurato le forze<sup class=…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Sandra N. Manosalvas-Kjono, Ladpli di Purim, Farah Memon, Divya Gopisetty e Veronica Sanchez per supporto nella progettazione del dispositivo e della generazione di animali mutanti. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH R01EB006745 (di BLP), R01NS092099 (di MBG), K99NS089942 (per MK), F31NS100318 (per ALN) e ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell’ambito dell’Unione europea Horizon 2020 ricerca e innovazione programma ( Convenzione n. 715243 di sovvenzione MK).
Materials
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric – imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
Riferimenti
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