マイクロ流体デバイスを用いた機械的刺激と線虫の高解像度イメージング
Summary
メカノバイオロジー研究のための新しいツールはどのように機械的ストレスを理解に必要な生化学的経路を活性化し、生体反応を引き出します。ここでは、細胞応答の高分解能イメージングをできるようにマイクロ トラップで固定化動物の選択的な機械的刺激のための新しい方法を紹介します。
Abstract
1 つの中央目標メカノバイオロジーの蛋白質および細胞のメカニカル ストレスの相互影響を理解することです。その重要性にもかかわらず機械的ストレスの細胞機能に及ぼす影響はまだよくわかっていません。いくつかのツールは、組織や細胞の同時変形、生きている動物の細胞の活動のイメージングと線虫など、それ以外の場合高度なモバイル モデル生物運動の効率的な制限を有効にするためにこの知識のギャップが存在する部分には、線虫。線虫 c. エレガンスのサイズが小さいマイクロ ベースの研究装置に優れた一致のため、マイクロ流体デバイスを用いた固定化のためのソリューションを提示されています。これらのデバイスは高分解能イメージングを使用、動物はポリジメチルシロキサン (PDMS)、ガラス、機械的な力や電気生理学的記録の配信のための物理的なアクセスを制限することに完全に包まれています。最近では、高解像度蛍光顕微鏡と互換性のあるトラップ デザインと空気圧アクチュエータを統合したデバイスを作成しました。作動チャネルは、薄い PDMS ダイヤフラムでワーム トラップ チャネルから区切られます。この振動板は、外部ソースからの圧力を適用することによってワームの側面にそらされます。デバイスは、個々 の機械受容ニューロンをターゲットできます。これらのニューロンの活性化でイメージはカルシウムの遺伝子にコードされた指標と高解像度。この記事は、接触受容体ニューロン (TRNs) でカルシウムに敏感なアクティビティ インジケーター (GCaMP6s) を表現する線虫の系統を用いた一般的な方法を示します。メソッドはしかし、プローブと TRNs にもカルシウム センサーに限定ではない、他の機械的に敏感な細胞またはセンサーに拡張できます。
Introduction
タッチの感覚は、彼らの環境に関する重要な情報を持つ動物を提供します。適用された力によって、無害な楽しい、または痛みを伴う、タッチは感知されます。タッチの中に組織の変形は、最もよくイオン チャンネル受容体蛋白質を表現する皮膚に埋め込まれた特殊な受容細胞によって検出されます。タッチと痛みの間にイオン チャネル活性化への力覚のリンク手順が完全に理解されていません。さらに少ないは、皮膚組織が機械的変形、メカノレセプターがひずみの変化を検出するかどうかをフィルターか1,2,3のストレスについて知られています。一部、このギャップの理解では、生きている動物の皮の表面に細胞レベルで反応を観察しながら正確な機械的刺激を適用する適切なツールの欠如から発生します。適用し、隔離されたセル4,5で力を測定してもリビングの Piezo1 受容体を有効にして、原子間力顕微鏡を広く使用されているに対し細胞6、特に生きている動物を使用して同様の実験は、 線虫、被写体の本質的なモビリティのために悪名高く挑戦されています。この挑戦は、伝統的寒天パッド1,7,8,9の個々 の動物を固定する獣医または手術用シアノアクリ レート系接着剤を使用して回避します。このアプローチは、生産されているが、接着剤と機械的コンプライアンスの軟寒天培地表面固定化に必要なスキルに関連する制限があります。マイクロ流体戦略は、接着にリンクされている合併症のいくつかを回避する無料の代替です。
線虫は動物のサイズのために、マイクロ流体技術のためのよい適合をある完全にマップされた神経系の遺伝モデル生物です。マイクロ ベースのデバイスは高分解能イメージングと関連する神経調節刺激の配信を行いながらそれ以外の場合非常にモバイルの動物を抑制できるという利点を提供しています。マイクロ流体の助けを借りて技術、動物の生活は害10,11, 生涯12,13上行動活動の監視と高解像度を実現することがなく固定化することができます。神経活動14,15,16,17のイメージング。さらに、タッチと痛みの感覚は、生理1,8、機械式4,18,19、特徴付けることができるために必要な多くの受容ニューロン分子レベル20,21,22。
線虫 c. エレガンス6 TRNs、動物の前部 (ALML/R と AVM) を支配する 3 つのうち、3 つは動物の後部 (PLML/R と PVM) を支配するを使用してその体壁に穏やかな機械的刺激を感覚します。生化学的信号に適用された力の伝達に必要なイオン チャネル分子は TRNs8で幅広く研究されています。本稿では正確な機械力を固定化c. の elegansの皮膚に適用する研究者を可能にするマイクロ流体プラットフォーム23回虫、光イメージングによるその内部組織の変形を読みながら。明確に定義された機械的刺激を提示に加えてカルシウム トランジェントを受容ニューロン細胞レベル下の解像度で記録し、形態学的および解剖学的機能と相関できます。デバイスは、単一の動物を保持し、その皮膚 (図 1および図 2) 六つの空気圧アクチュエータのチャンネルの横にあるを示す中央トラップ チャネルで構成されます。六つのチャンネルは、各ワームの 6 TRNs に機械的刺激を提供するトラップ チャネルに沿って配置されます。これらのチャネルは、薄い PDMS のダイヤフラムがあり、外部の空気圧力源 (図 1) によって駆動することができますでトラップ室から区切られます。圧力に対する変形を校正この記事で測定を提供しています。各アクチュエータは、個別に対処し、好みの受容を促進するために使用できます。ピエゾ駆動圧力ポンプを使用して圧力を配信、任意の代替デバイスを使用できます。TRNs体内をアクティブにし、大人の線虫に機械的刺激を提供する、デバイスに大人動物の読み込み、カルシウム イメージングを実行する適切な操作装置を示す圧力プロトコルを使用できることを示す実験と結果の分析します。デバイスの作製は、2 つの主な手順で構成されています: 1) SU-8; から金型を作るフォトリソグラフィー・ 2) デバイスにする PDMS を成形します。簡潔、明瞭のために以前に公開された記事およびプロトコル24,25金型とデバイスを生成する方法について読者が呼ばれます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、マイクロ流体チップの中に閉じ込め回虫の皮膚に正確な機械的刺激を提供する方法を示します。それは生物的質問に答えるための物理的な刺激の統合を容易にするものです、メカノバイオロジー研究生物ラボでの効率化を目指します。このメソッドは、線虫の機械刺激受容ニューロンの機能を評価するために前の試金を拡張します。以前の定量的、半定量的な手法?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 はサンドラ N. Manosalvas-Kjono、プリム Ladpli に感謝、ファラー Memon、Divya Gopisetty、ヴェロニカ ・ サンチェスのサポート デバイス設計、変異動物の世代。この研究はサポートされている NIH 助成金 R01EB006745 (BLP)、(MBG) に R01NS092099、K99NS089942 (MK) に、(ALN) を F31NS100318、受信した欧州連合のホライゾン 2020年研究と技術革新の下で欧州研究会議 (ERC) からの資金調達のプログラム (付与契約号 715243 MK)。
Materials
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric – imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
Riferimenti
- Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
- Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
- Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
- O’Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
- Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Li, S., Stone, H. a., Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
- Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
- Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
- Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
- Arnadóttir, J., O’Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
- Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
- Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O’hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
- Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
- Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
- Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
- Petzold, B. C., Park, S. -. J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
- Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).
- Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
- Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).
