Mekanik stimülasyon ve yüksek çözünürlük görüntüleme C. elegans bir havacilik aygıtı kullanma
Summary
Mechanobiology araştırma için yeni araçlar nasıl mekanik stres anlamak için gerekli biyokimyasal yollar etkinleştirir ve biyolojik yanıt aydınlığa çıkartıyor. Burada, hücresel tepkilerin yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan bir mikrosıvısal tuzak ile immobilize hayvanların seçici mekanik uyarılması için yeni bir yöntem vitrin.
Abstract
Mechanobiology bir merkezi amacı karşılıklı etkisi protein ve hücreleri mekanik stres anlamaktır. Önemini rağmen hücresel fonksiyonu mekanik stres etkisi hala kötü anlaşılmaktadır. Birkaç araçlarını etkinleştirme nedeniyle aynı anda deformasyon doku ve hücreleri, Canlı hayvanlarda hücresel hareketlilik görüntüleme ve verimli sınırlama-in hareketliliği Yuvarlak solucanlar gibi aksi takdirde son derece mobil model organizmalarda kısmen, bu bilgi boşluğu bulunmaktadır Caenorhabditis elegans. C. elegans küçük boyutunu onları havacilik dayalı araştırma aygıtlar için mükemmel bir maç yapar ve mikrosıvısal aygıtlarını kullanarak immobilizasyon için çözümler sunulmuştur. Bu aygıtlar yüksek çözünürlükte görüntüleme için izin rağmen hayvan tamamen polydimethylsiloxane (PDMS) ve cam, mekanik güç ya da Elektrofizyolojik kayıtlar teslim etmek için fiziksel erişimi sınırlama kaplı olduğu. Son zamanlarda, yüksek çözünürlüklü Floresans mikroskobu ile uyumlu bir bindirme tasarım ile pnömatik aktüatörler entegre bir cihaz geliştirdi. Çalıştırma kanal solucan-bindirme kanaldan ince PDMS diyafram tarafından ayrılır. Bu diyafram içine belgili tanımlık yan-in bir kurt bir dış kaynaktan basınç uygulayarak uğramaktadır. Cihazın bireysel mechanosensitive nöronlar hedefleyebilirsiniz. Bu nöronların harekete geçirmek, yansıma genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeler ile yüksek çözünürlüklü. Bu makalede C. elegans suşları kalsiyum duyarlı etkinlik göstergesi (GCaMP6s) onların dokunmatik reseptör nöronlarda (TRNs) ifade kullanarak genel yöntem sunuyor. Yöntemi bir sonda TRNs ne de kalsiyum sensörler sınırlı değildir, ancak diğer mekanik olarak duyarlı hücreleri veya sensörler için genişletilebilir.
Introduction
Dokunma duygusu hayvanlar çevreleri hakkında çok önemli bilgiler sağlar. Bağlı olarak uygulanan kuvvet, dokunmatik zararsız, zevk veya acı olarak algılanmaktadır. Dokunmatik sırasında doku deformasyon reseptör proteinler, en sık iyon kanalları hızlı deride katıştırılmış özel mekanoreseptör hücreleri tarafından algılanır. Kuvvet algı iyon kanal etkinleştirme dokunma ve ağrı sırasında bağlanma adımları tam olarak anlaşılmış değildir. Daha az nasıl deri dokusu mekanik deformasyon ve gerginlik içinde mechanoreceptors değişiklikleri olup filtreler veya1,2,3stres bilinir. Bu boşluğu anlamada, kısmen, hassas mekanik elektrodlar kesilmediğini gözleyerek yanıt-e doğru hücresel düzeyde yaşayan hayvan cilt yüzeyine uygulamak için uygun araçlar eksikliği kaynaklanmaktadır. Atomik kuvvet mikroskobu kapsamlı uygulamak ve izole hücreler4,5 Kuvvetleri ölçmek için ve aynı zamanda yaşam Piezo1 reseptörleri etkinleştirmek için kullanılmıştır, ancak6, benzer deneyler yaşayan hayvanlar, özellikle kullanarak hücreler C. elegans, konu içsel hareketlilik nedeniyle Rootkitler zor olmuştur. Bu meydan okuma geleneksel olarak bireysel hayvanlar agar yastıkları1,7,8,9üzerinde hareketsiz için veteriner – veya cerrahi-sınıf cyanoacrylate tutkal kullanarak atlatılabilirdi. Bu yaklaşım üretken beri ama yapıştırma ve mekanik uygunluk yumuşak agar yüzeyinde immobilizasyon için gerekli beceri ile ilgili sınırlamalar vardır. Bazı yapıştırma için bağlı komplikasyonları önler bir ücretsiz alternatif havacilik stratejisidir.
Yuvarlak solucanlar C. elegans genetik model organizma bu hayvanın büyüklüğü nedeniyle, havacilik teknoloji için iyi bir seçimdir tamamen eşlenen bir sinir sistemi var. Havacilik tabanlı cihazlar teklif aksi takdirde son derece mobil hayvan yüksek çözünürlüklü görüntü ve ilgili nöro-düzenleyici uyaranların teslimat yaparken ölçülü avantaj. Mikrosıvısal yardımıyla teknolojileri, hayvanlar yaşayan bütün ömrünü12,13 üzerinde davranış faaliyet izleme ve yüksek çözünürlüklü etkinleştirme zararı10,11olmadan, etkisiz hale nöronal aktivite14,15,16,17ve görüntüleme. , Daha fazla dokunma ve ağrı hissi kendi fizyolojik1,8, mekanik4,18,19, karakterize edilebilir için gerekli birçok mekanoreseptör nöronlar ve moleküler seviye20,21,22.
C. elegans altı TRNs, üç olan hayvanın anterior (ALML/R ve AVM) innervate ve üç olan hayvanın arka (PLML/R ve PVM) innervate kullanarak kendi vücut duvar yumuşak mekanik uyaranlara hissediyor. Biyokimyasal bir sinyal uygulanan bir yürürlüğe transducing için gerekli iyon kanal molekülleri onun TRNs8‘ kapsamlı bir şekilde inceledik. Bu makalede araştırmacılar hassas mekanik kuvvetleri bir immobilize C. elegans kaplamasına uygulamak sağlayan bir mikrosıvısal platformu23 sunar kendi iç dokulara deformasyon tarafından optik görüntüleme okunurken yuvarlak kurt,. İyi tanımlanmış mekanik uyaranlara sunan ek olarak, kalsiyum geçişler mekanoreseptör nöron hücre altı çözünürlük ile kaydedilen ve morfolojik ve anatomik özellikleri ile ilişkili. Cihazın kendi cilt altı pnömatik çalıştırma kanalları (Resim 1 ve Şekil 2) yanındaki sunar ve tek bir hayvan tutan bir merkezi bindirme kanalı oluşur. Altı kanala mekanik uyaranlara her solucan’ın altı TRNs sunmak için bindirme kanalı boyunca konumlandırılır. Bu kanallar bir dış hava basınç kaynağı (şekil 1) tarafından yürütülen ince PDMS Diaframlar, bindirme odasından ayrılır. Saptırma basınç ile ilgili olarak kalibre edilmiş ve bu makaledeki ölçümler sağlamak. Her aktüatör ayrı ayrı ele alınması ve seçim mekanoreseptör uyarmak için kullanılır. Basınç bir piezo-driven basınç pompası kullanılarak teslim edilen ancak başka herhangi bir aygıtı kullanılabilir. Biz basınç Protokolü TRNs vivo içinde harekete geçirmek ve çalışma cihazları mekanik uyaranlara için yetişkin C. elegansteslim, Yetişkin hayvanların içine aygıt yükleme, kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için uygun göstermek için kullanılabilir göstermek deneyleri ve sonuçlarını çözümleme. Cihaz imalat iki ana adımlardan oluşur: 1) SU-8; bir kalıp yapmak fotolitografi ve 2) bir cihaz yapmak için PDMS kalıp. Kısalık ve netlik uğruna, okuyucular için daha önce yayımlanmış makaleleri ve protokoller24,25 kalıpları ve cihazlar üretmek konusunda yönergeler için denir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı bir mikrosıvısal çip sıkışmış bir yuvarlak kurt cilt için hassas mekanik stimülasyon teslim etmeye yönelik bir yöntem gösterir. Bu biyolojik sorulara cevap için fiziksel uyaranlara entegrasyonunu kolaylaştırmak için tasarlanmıştır ve mechanobiology araştırma biyolojik Labs’de düzene amaçlamaktadır. Bu yöntem mechanosensory nöronlarda C. elegansişlevini değerlendirmek için önceki deneyleri genişletir. Önceki nicel ve yarı kantitatif teknikleri Kuvvetleri<sup …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sandra N. Manosalvas-Kjono, Purim Ladpli teşekkür ediyoruz, Farah Memon, Divya Gopisetty ve Veronica Sanchez için aygıt tasarım ve mutant hayvanlar nesil destek. Bu araştırma desteklenmiştir NIH hibe tarafından R01EB006745 (BLP), R01NS092099 (için MBG), K99NS089942 (MK için) F31NS100318 (için ALN) ve Avrupa Birliği’nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik altında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) üzerinden alınan finansman programı () Sözleşme No 715243 vermek MK için).
Materials
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric – imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
Riferimenti
- Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
- Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
- Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
- O’Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
- Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Li, S., Stone, H. a., Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
- Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
- Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
- Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
- Arnadóttir, J., O’Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
- Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
- Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O’hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
- Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
- Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
- Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
- Petzold, B. C., Park, S. -. J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
- Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).
- Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
- Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).
