Un metodo semplice per preparare BSA-degli acidi grassi coniugati e illustriamo un metodo semplice per derivare macrofagi murini primari da cellule del midollo osseo. Allora dimostriamo che gli acidi grassi saturi può indurre la morte delle cellule del macrofago, e tale morte delle cellule è associato positivamente con accumulo cellulare di ceramide livelli.
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Articolo metodologico
Acidi grassi saturi indurre la morte delle cellule del macrofago Ceramide-collegato
In questo articolo
Sommario
Abstract
I macrofagi esprimono altamente epidermica dell'acido grasso-proteina e proteina-acido grasso adiposa. Essi attivamente l'assorbimento saturata e acidi grassi insaturi, che potrebbe giocare un ruolo critico nella regolazione della loro funzioni immuni. Numerosi studi hanno dimostrato che vari acidi grassi, saturi o insaturi, può possedere diversi impatti sulla crescita delle cellule e la funzione. Tuttavia, gli approcci utilizzati per la preparazione dell'acido grasso variano, che può portare a risultati non-fisiologica. Albumina, un vettore naturale per gli acidi grassi nel sangue periferico dei mammiferi, è consigliabile per la formazione di un coniugato complesso con il sale di sodio degli acidi grassi per studiare la funzione dell'acido grasso in cellule di mammifero, riducendo così al minimo la tossicità dell'acido grasso sapone. Così, un semplice, relativamente rapido riscaldamento e sonicating metodo è sviluppato e presentato qui per la formazione di coniugato acido grasso-BSA. Descriviamo un protocollo utilizzando acidi grassi saturi, soprattutto gli acidi stearico di indurre morte cellulare severa nei macrofagi derivato del midollo osseo del topo. Noi dimostrare ulteriormente che la morte cellulare indotta da acido grasso saturo è associata positivamente con ceramide cellulare accumulato livelli. Questo metodo può essere esteso per lo studio dell'impatto dell'acido grasso sulle altre cellule di mammiferi.
Introduzione
Acidi grassi svolgono un ruolo critico nel metabolismo energetico e nella sintesi dei fosfolipidi di membrana in diversi tipi di cellule. Gli acidi grassi hanno una bassa solubilità in acqua. Una preparazione adeguata degli acidi grassi è di importanza critica per studiare le funzioni biologiche degli acidi grassi nelle cellule dei mammiferi. Quando gli acidi grassi sono preparati con etanolo, molti acidi grassi può mostrare il loro effetto tossico sapone (detersivo) sulla membrana cellulare, anche a concentrazioni relativamente basse1. Come un trasportatore naturale, importante per gli acidi grassi liberi nel siero, l'albumina di siero è consi....
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Protocollo
il protocollo è stato approvato dalla istituzionale Animal Care and uso Committee (IACUC) della University of Louisville.
1. macrofagi derivati del midollo osseo di topo (BMDMs)
- Euthanize un mouse di tipo selvaggio a 8-week-old 6, sano usando CO 2. Aggiungerla a un bordo della gomma piuma e spruzzarlo con etanolo al 70%, fino a quando è bagnato. Togliere le ossa tibia/femore con pinze e le forbici. Metterli in una capsula di Petri con 5 mL 1 x tampone fosfato salino (PBS). Eseguire tutte le procedure in condizioni sterili.
- Tagliato aperto a entrambe le estremità della tibia/femore con una forbice in un cappu....
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Risultati
L'obesità aumenta le concentrazioni di acidi grassi liberi nel siero. Come fagociti professionali, macrofagi prendono attivamente gli acidi grassi per mantenere l'omeostasi host. Durante questi processi, Overload lipidi possono indurre la morte delle cellule del macrofago. A tal fine, abbiamo coltivato BMDMs in vitro con obesi livelli di acidi grassi dietetici e morte delle cellule del macrofago misurato usando flusso cytometric macchiatura. Rispetto al controllo di BSA, acidi gr.......
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Discussione
La corretta preparazione della soluzione di acido grasso è di importanza critica per studiare la funzione biologica degli acidi grassi. La neutralizzazione degli acidi grassi aumenta la relativa solubilità in soluzione acquosa. Tuttavia, sali di sodio degli acidi grassi, soprattutto acidi grassi saturi, sono ancora di bassa solubilità in acqua o PBS, come abbiamo osservato. Un metodo consiste nell'utilizzare etanolo al 95-100% per aiutare a sciogliere l'acido grasso1. Utilizzando questo metodo, ma.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto parzialmente dai fondi di Start-up Università di Louisville e National Cancer Institute (Bethesda, MD) concede R01CA177679, R01CA180986.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bagno ad ultrasuoni CPX | Bransonic | Modello 2800 | |
| Palmitato di sodio (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Stearato di sodio (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Albumina sierica bovina (BSA), priva di acidi grassi | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Fattore stimolante le colonie di macrofagi di topo (mM-CSF) | Tecnologia di segnalazione cellulare, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 coniugato | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Anticorpo monoclonale anti-ceramide (IgM di topo) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, & micro; catena, FITC coniugato | Sigma | AP128F | |
| Tampone di fissazione | Biolegend | 420801 | |
| Tampone di permeabilizzazione | Ebioscience | 4307693 | |
| Tampone per lisi dei globuli rossi | Sigma | 11814389001 | |
| Annanina V Cuscinetto di legame | BD Biosciences | 556454 | |
| cellule L929 | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Sollevatore cellulare | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Nota: M.W. sta per peso molecolare. |
Riferimenti
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S.
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Ristampe e permessi
