L'effetto di Stress osmotico su vescicole secretorie ed esocitosi di monitoraggio

Sommario

Lo stress osmotico colpisce esocitosi e la quantità di neurotrasmettitore rilasciato durante questo processo. Dimostriamo come combinando metodi elettrochimici insieme con microscopia elettronica di trasmissione può essere utilizzato per studiare l'effetto della pressione osmotica extracellulare per attività di esocitosi, vescicola quantal dimensione e la quantità di neurotrasmettitore rilasciato durante esocitosi.

Abstract

Amperometria registrazione delle cellule sottoposti a shock osmotico dimostrano che cellule secretive rispondono a questo sforzo fisico riducendo l'attività di esocitosi e la quantità di neurotrasmettitore rilasciato da vescicole in eventi di singolo esocitosi. È stato suggerito che la riduzione in neurotrasmettitori espulso è dovuto le alterazioni nella proprietà biofisiche della membrana quando cellule restringono in risposta allo stress osmotico e con presupposti che non sono interessate vescicole secretorie nel citoplasma delle cellule da extracellulare stress osmotico. Amperometria registrazione di esocitosi monitora ciò che viene rilasciato dalle cellule al momento una vescicola si fonde con la membrana plasmatica, ma non fornisce informazioni sul contenuto della vescicola prima che la fusione della vescicola è attivata. Pertanto, combinando amperometria registrazione con altri metodi analitici complementari che sono in grado di caratterizzare le vescicole secretorie prima che venga attivato l'esocitosi alle cellule offre una panoramica più ampia per l'esame come secretive vescicole e la processo di esocitosi sono interessati da shock osmotico. Qui descriviamo come complemento amperometria registrazione con intracellulare cytometry elettrochimica e formazione immagine di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione può essere utilizzato per caratterizzare le alterazioni nei contenuti di dimensione e neurotrasmettitore di vescicole secretorie in cellule cromaffini in relazione all'attività di esocitosi prima e dopo l'esposizione a stress osmotico. Collegando le informazioni quantitative acquisite dagli esperimenti utilizzando tutti i tre metodi di analisi, conclusioni sono state fatte in precedenza che vescicole secretorie rispondano agli stress osmotico extracellulare shrinking nel formato e riducendo la dimensione quantal vescicola a mantenere una concentrazione di neurotrasmettitore costante della vescicola. Quindi, questo dà alcuni chiarimenti per quanto riguarda perché le vescicole, in risposta a stress osmotico, riducono i neurotrasmettitori di importo rilasciati durante il rilascio di esocitosi. Le registrazioni di amperometrico qui indicano che questo è un processo reversibile e quella della vescicola dopo shock osmotico sono riforniti con neurotrasmettitori quando posizionate cellule vengono ripristinate in un ambiente isotonico.

Introduzione

Le cellule cromaffini in ghiandole surrenali sono cellule neuroendocrine che rilasciano molecole di neurotrasmettitore nel flusso sanguigno. Questo avviene attraverso un processo cellulare che coinvolge l'attracco e la fusione delle vescicole piene di neurotrasmettitori, conseguente rilascio contenuto dalle vescicole allo spazio extracellulare in un processo chiamato esocitosi. I neurotrasmettitori (adrenalina e noradrenalina) nelle cellule cromaffini sono attivamente trasportati da proteine di membrana in vescicole grande nucleo denso (LDCVs) e conservati a alte concentrazioni (~0.5-1 M)^1,2. Accumulazione dei....

Protocollo

1. cella cultura delle cellule cromaffini Bovine isolate tramite digestione enzimatica dalle ghiandole surrenali

1. Per isolare le cellule cromaffini raccolte dalle ghiandole surrenali bovini, sterilizzare le cellule con una soluzione di etanolo 70%. Tagliare via grasso e tessuto connettivo usando un bisturi. Per rimuovere sangue, sciacquare le vene surrenali utilizzando soluzione di Locke (154mm NaCl, KCl 5.6 mM, NaHCO3 3.6 mM, idrossietil piperazineethanesulfonic acido (HEPES) 5,6 mM a pH 7.4) che è stato termostatato a 37 ° C.
2. Per digerire il tessuto, gonfiare ogni ghiandola iniettando circa 2,5 mL di soluzione collagenasi P 0,2% del filtrato steri....

Risultati

Descriviamo qui il protocollo per come formazione immagine TEM insieme due metodologie elettrochimiche, fibra di carbonio amperometria e intracellulare cytometry elettrochimica, la combinazione può fornire informazioni che guadagna una visione più ampia, alludendo all'effetto di pressione osmotica extracellulare su vescicole secretorie e il processo di esocitosi. Confrontando il rappresentante amperometrico registrazioni di esocitosi rilascio alle singole cellule cromaffini utilizzando lo sperimentale istituito (mostrato.......

Discussione

Qui presentiamo un protocollo e i vantaggi della combinazione di tre metodi analitici complementari per analizzare le vescicole secretorie e il processo di esocitosi di acquisire una migliore comprensione di come una forza fisica come la pressione osmotica può influenzare le vescicole secretorie e il processo di esocitosi in cellule secretive. Questi metodi includono amperometria microelettrodo di fibra di carbonio, che è un metodo consolidato per la registrazione di attività di esocitosi, intracellulare cytometry elettr.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
KCl	Sigma Aldrich	P9333
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma Aldrich	M-2670
Glucosio	Sigma Aldrich	G8270
Collagenasi P	Roche, Svezia	11 213 857 001
100-µ M Rete di nylon	Fisher Sientific	08-771-19
Percoll	Sigma Aldrich	P1677
Collagene IV rivestito 60 mm piatto di plastica	VWR	354416
Centrifuga	Avanti J-20XP
Capillare in vetro borosilicato	Sutter instrument Co., Novato, CA
Estrattore di micropipette	Narishing Inc., Giappone	PE-21
Soluzioni epossidiche (A e B)	Tecnologia epossidica, Billerica, MA
Smussatrice	Narishing Inc.	EG-400
	Olympus	IX81
	Dispositivi molecolari, Sunnyvale, CA	Micromanipolatore Axopatch 200B
Burleigh Instrument Inc., USA	PCS-5000
Fiamma butano	Multiflame AB, Hä sselholm, Svezia
Microscopia elettronica a trasmissione	Omega	Leo 912 AB

Microscopio invertito Strumento a morsetto patch