في المختبر قياس إنزيم لاختبار الاستجابة الدوائية والوصيفة في فابري ومرض بومبي
Summary
وهناك طلب لجعل ما قبل السريرية الاختبار لفئة رواية اليتيمة “المخدرات يسمى مرافقين الدوائي استنساخه وسريعة وفعالة. وضعنا مقايسة على أساس الثقافة خلية بسيطة وموحدة شديدة وتنوعاً على الشاشة للمرضى المؤهلين، فضلا عن العقاقير وصي الدوائي الرواية.
Abstract
استخدام الأدوية المخصصة لعلاج الأمراض مونوجينيك النادرة مثل اضطرابات التخزين الليزوزومية (النساء) هو تحدي التصاميم المحاكمة السريرية المعقدة وتكاليف عالية، وانخفاض عدد المرضى. مئات الآليلات متحولة متورطة في معظم النساء. الأمراض التي تصنف عادة إلى 2 إلى 3 أنواع سريرية مختلفة حسب شدتها. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يساعد التوصيف الجزيئي للنمط الوراثي التنبؤ بالنتائج السريرية وأبلغ العناية بالمرضى. ولذلك، قمنا بتطوير مقايسة ثقافة خلية بسيطة تستند إلى خلايا HEK293H هيتيرولوجوسلي الإفراط معربا عن الطفرات تم تحديدها في مرض فابري وبومبي. قد أدخلت مؤخرا مقايسة مماثلة كاختبار الإكلينيكية التعرف على الطفرات قابلة للعلاج وصي الدوائية (PCT) في مرض فابري. ويصف هذه المخطوطة مقايسة ثقافة خلية معدلة التي تمكن من تقييم المظهرية السريع للمتغيرات الجينية في مرض فابري وبومبي لتحديد المرضى المؤهلون للمعاهدة وقد تساعد في تطوير فارماكوتشابيرونيس الرواية.
Introduction
هناك أكثر من اثنتي عشرة التخزين الليزوزومية اضطرابات (النساء) تتصل بالخلل جليكوسيداسي نتيجة للطفرات الجينية الأولية. فابري (OMIM #301500) ومرض بومبي (OMIM #232300)، أكثر من 500 و 200 من الطفرات مغلطه وأبلغ1،2،3 ، على التوالي، التي تتطابق مع حوالي 60 في المائة العدد الإجمالي طفرة. لا يزال يجري تحديد العديد من المتغيرات الجينات الجديدة، والكثير منها معروف أهمية. كشفت دراسات مستفيضة البيوكيميائية أن بعض الأنماط الجينية لا تؤدي إلى فقدان-من-وظيفة كاملة من الجينات GLA (OMIM * 300644) في مرض فابري، بل تسبب الإنزيم المقابلة إلى فشل في الوصول إلى حالة قابلة لطي [ثرمودنميكلي] يفضل4 . هذه النتائج في استبقاء ER وتدهور سابق لأوانه إنزيم الفنية خلاف ذلك. قد تم استخلاص استنتاجات مماثلة في سائر النساء بما في ذلك مرض بومبي5. وعلاوة على ذلك، يمكن تسهيل التوصيف الجزيئي للمتغيرات إنزيم التفسير السريري للطفرات في وقت التشخيص6، مما يوحي بأن تطور LSD عملية فردية استناداً إلى طبيعة الطفرة. ولذلك، ينبغي إعادة تقييم التصنيف التقليدية إلى أنواع سريرية مختلفة عادة ما بين 2 إلى 3 بغية تبسيط المشورة الطبية والقرارات العلاجية.
العلاج باستبدال إنزيم (ERT) متاح لكلا المرضين. بيد أن فريق خبراء الاستعراض، قد محدودة فعالية في الأنسجة/الأجهزة المتأثرة مثل الدماغ والعضلات. وعلاوة على ذلك، يمكن الحصول على فريق خبراء الاستعراض استجابة مكسبه يهدد فوائدها العلاجية. المحرمين الدوائية (أجهزة كمبيوتر) بديل جذابة علاج للمرضى المصابين بما يسمى الطفرات استجابة. أجهزة الكمبيوتر بمثابة سقالة جزيئية لطي البروتين الصحيح وتحقيق الاستقرار الذي يمنع بدوره الاحتفاظ هيولى (ER) وتدهور الإنزيم المرتبطة ER. وعلاوة على ذلك، أجهزة الكمبيوتر يمكن أن تدار شفويا، ويحتمل أن تكون قادرة على عبور حاجز الدم في الدماغ. ولذلك، قد تكون المعاهدة خياراً قابلاً للتطبيق أكثر لعلاج المرضى الذين يعانون من بعض الأنماط الجينية. لاستعراض مستفيض في تطبيق الكمبيوتر في النساء، الرجوع إلى استعراض ممتازة بارينتي7.
اكتشاف مئات أمراض التي تسبب الآليلات متحولة التحديات اختبار المخدرات قبل الإكلينيكية ويستلزم إجراء تقييم بسيطة وسريعة وعالية موحدة للمرضى قابلة للأخذ بنهج طب شخصية. من أجل تقييم الآثار الضارة للطفرات الجينية LSD واختبار الطفرات المرشح للتنبؤ المرضى قابلة للبراءات، كان نظام تعبير المفرط موحدة عالية في خلايا HEK293H التي تسمح بقياس نشاط الإنزيم سريعة وموثوق بها البلدان المتقدمة النمو. نظم التعبير المفرط مماثلة قد وصفت سابقا لمرض فابري وبومبي باستخدام أما كوس-78،9،،من1011أو خلايا هيلا12أو HEK29313 14، ،،من1516 الخلايا للجينات جليكوسيداسي.
طريقة مشابهة جداً، حتى تم تسجيل براءة اختراع “وسيلة للتنبؤ باستجابة للعلاج الدوائي والوصيفة من الأمراض”17 تشير إلى أهمية خلية ثقافة نظام قادر على إدماجها في الممارسة السريرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسلم البروتوكول المبينة في هذا التقرير نتائج قوية لتقييم الأضرار الإنزيم في أمراض وراثية الليزوزومية من الأيض. هذه المخطوطة إدخال تعديل على البروتوكول ونشرت قبل15. أهم التعديلات التي تنطوي على صرامة (أيعملية إعداد بناء ناقلات متحولة)، توحيد البروتوكول ثقافة الخلية (أي…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تود أن تقر لوبيرت ماندي وتينا كزاجكا للدعم الفني الممتاز. نشكر لوه النباتات (كلية الطب في جامعة هارفارد، بوسطن، ماجستير، الولايات المتحدة الأمريكية) لتحرير تعليمات اللغة.
Materials
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
| Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
| Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
| Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
| Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
| GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
| Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
| Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
| water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
| Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
| Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
| Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
| CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
| Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
| BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = not applicable |
Riferimenti
- Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
- Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
- Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
- Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
- Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
- Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331 (2008).
- Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66 (2011).
- Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092 (2014).
- Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
- Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
- Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
- Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632 (2013).
- Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
- . Available from: https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017)
- Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
- Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
- Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
- Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
- Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
- Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111 (2013).
- Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
- Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91 (2012).
- Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
- Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
- Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).
