इन विट्रो एंजाइम माप Fabry और धूमधाम से रोग में औषधीय निगरानी जवाबदेही का परीक्षण करने के लिए
Summary
वहां एक मांग के लिए पूर्व नैदानिक परीक्षण करने के लिए “अनाथ” दवाओं के एक उपंयास वर्ग के लिए बुलाया औषधीय chaperones प्रतिलिपि, तेज, और कुशल । हम विकसित एक सरल, उच्च मानकीकृत, और बहुमुखी कोशिका संस्कृति आधारित परख के लिए पात्र रोगियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपंयास औषधीय निगरानी दवाओं के लिए स्क्रीन ।
Abstract
व्यक्तिगत दवा का उपयोग लाइसोसोमल भंडारण विकारों (LSDs) की तरह दुर्लभ monogenic रोगों के इलाज के लिए जटिल नैदानिक परीक्षण डिजाइन, उच्च लागत, और कम रोगी संख्या द्वारा चुनौती दी है । उत्परिवर्ती alleles के सैकड़ों LSDs के अधिकांश में फंसा रहे हैं । रोगों आम तौर पर गंभीरता के अनुसार 2 से 3 अलग नैदानिक प्रकार में वर्गीकृत कर रहे हैं । इसके अलावा, जीनोटाइप के आणविक लक्षण वर्णन मदद नैदानिक परिणामों की भविष्यवाणी और रोगी देखभाल सूचित कर सकते हैं । इसलिए, हम एक सरल सेल संस्कृति परख HEK293H कोशिकाओं पर आधारित heterologously पर Fabry और धूमधाम से रोग में पहचान उत्परिवर्तनों व्यक्त विकसित की है । इसी तरह की परख हाल ही में एक नैदानिक परीक्षण के रूप में पेश किया गया है Fabry रोग में औषधीय निगरानी चिकित्सा (पीसीटी) के लिए नवागत उत्परिवर्तनों की पहचान । इस पांडुलिपि एक संशोधन सेल संस्कृति परख जो Fabry और धूमधाम से allelic वेरिएंट के तेजी से phenotypic आकलन में सक्षम बनाता है पीसीटी के लिए पात्र रोगियों की पहचान और उपंयास pharmacochaperones के विकास में सहायता कर सकते है वर्णन करता है ।
Introduction
वहां एक दर्जन से अधिक लाइसोसोमल भंडारण विकारों (LSDs) प्राथमिक जीन उत्परिवर्तनों का एक परिणाम के रूप में glycosidase रोग से संबंधित हैं । Fabry में (OMIM #301500) और धूमधाम (OMIM #232300) रोग, अधिक से अधिक ५०० और २००2भावना उत्परिवर्तनों,3 क्रमशः, रिपोर्ट किया गया है, जो कुल उत्परिवर्तन गिनती के बारे में ६०% से मेल खाती है । कई नए जीन वेरिएंट अभी भी पहचाना जा रहा है, जिनमें से बहुत से अज्ञात महत्व है । व्यापक जैव रासायनिक अध्ययन से पता चला कि कुछ पादी के लिए एक पूर्ण हानि का नेतृत्व नहीं करते-समारोह के GLA जीन (OMIM * ३००६४४) Fabry रोग में है, लेकिन इसी एंजाइम के कारण तक पहुंचने में विफल करने के लिए एक ऊष्मा इष्ट तह राज्य4 . एर प्रतिधारण और अंयथा कार्यात्मक एंजाइम की समय से पहले गिरावट में यह परिणाम है । इसी तरह के निष्कर्ष धूमधाम से५रोग सहित अन्य LSDs में तैयार किए गए हैं. इसके अलावा, एंजाइम वेरिएंट के आणविक लक्षण वर्णन6निदान के समय में उत्परिवर्तनों की नैदानिक व्याख्या की सुविधा कर सकते हैं, सुझाव है कि एलएसडी प्रगति एक व्यक्ति उत्परिवर्तन की प्रकृति के आधार पर प्रक्रिया है । इसलिए, आमतौर पर 2 से 3 विभिंन नैदानिक प्रकार में पारंपरिक वर्गीकरण क्रम में नैदानिक परामर्श और चिकित्सीय निर्णय को कारगर बनाने के लिए पुनर्मूल्यांकन किया जाना चाहिए ।
एंजाइम रिप्लेसमेंट थेरेपी (ईआरटी) दोनों रोगों के लिए उपलब्ध है । ईआरटी, तथापि, प्रभावित ऊतकों में सीमित प्रभावकारिता/अंगों जैसे मस्तिष्क और कंकाल की मांसपेशी । इसके अलावा, ईआरटी एक immunogenic प्रतिक्रिया है कि अपने चिकित्सीय लाभ ख़तरे में डालना कर सकते हैं । औषधीय Chaperones (पीसीएस) तथाकथित उत्तरदाई उत्परिवर्तनों के साथ रोगियों के लिए एक आकर्षक उपचार विकल्प हैं । पीसी सही प्रोटीन तह और स्थिरीकरण के लिए एक आणविक पाड़ के रूप में सेवा जो बारी में endoplasmic जालिका (एर) प्रतिधारण और एर एंजाइम के जुड़े क्षरण को रोकता है । इसके अलावा, पीसी मौखिक रूप से प्रशासित किया जा सकता है और संभावित रक्त मस्तिष्क बाधा पार करने में सक्षम हैं । इसलिए, पीसीटी कुछ पादी के साथ रोगियों के इलाज के लिए एक अधिक व्यवहार्य विकल्प हो सकता है । LSDs में पीसी आवेदन पर एक व्यापक समीक्षा के लिए, Parenti7द्वारा उत्कृष्ट समीक्षा करने के लिए देखें ।
उत्परिवर्ती alleles चुनौतियों पूर्व नैदानिक दवा परीक्षण और आवश्यक एक व्यक्तिगत दवा दृष्टिकोण के लिए नवागत रोगियों के एक सरल, तेज, और उच्च मानकीकृत आकलन के कारण रोग के सैकड़ों की खोज. आदेश में एलएसडी जीन उत्परिवर्तनों के हानिकारक प्रभावों का आकलन करने के लिए और उंमीदवार उत्परिवर्तनों परीक्षण के लिए पीसीटी के लिए नवागत रोगियों की भविष्यवाणी, एक उच्च मानकीकृत HEK293H कोशिकाओं है कि तेजी से और विश्वसनीय एंजाइम गतिविधि माप के लिए अनुमति देता में अभिव्यक्ति प्रणाली पर विकसित. इसी तरह की अधिक अभिव्यक्ति प्रणालियों पहले Fabry और धूमधाम से या तो प्रयोग रोग के लिए वर्णित किया गया है-78,9,10,11, हेला कोशिकाओं12, या HEK29313 ,glycosidase जीन के लिए14,15,16 कोशिकाएं हैं ।
एक बहुत ही विधि भी एक विधि “के रूप में पेटेंट कराया गया है रोगों के औषधीय निगरानी उपचार के लिए प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी”17 एक कोशिका संस्कृति नैदानिक अभ्यास में एकीकृत किया जा रहा करने में सक्षम प्रणाली की प्रासंगिकता का संकेत ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल चयापचय के वंशानुगत लाइसोसोमल रोगों में एंजाइम क्षति आकलन के लिए मजबूत परिणाम बचाता है । यह पांडुलिपि पहले15प्रकाशित प्रोटोकॉल में एक संशोधन है । सबसे महत्वपूर्ण संशोध?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक मैंडी Loebert और टीना Czajka को उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन के लिए स्वीकार करना चाहते हैं । भाषा संपादन मदद के लिए हम फ्लोरा लुओ (हार्वर्ड मेडिकल स्कूल, बोस्टन, एमए, यूएसए) को धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
| Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
| Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
| Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
| Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
| GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
| Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
| Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
| water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
| Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
| Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
| Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
| CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
| Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
| BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = not applicable |
Riferimenti
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