In Vitro Misurazione di enzima per Test farmacologici Chaperone reattività in Fabry e malattia di Pompe
Summary
C’è una domanda per fare pre-clinica test per una nuova classe di farmaci “orfani” chiamato chaperoni farmacologici riproducibile, veloce ed efficiente. Abbiamo sviluppato un test cellulari semplice, altamente standardizzate e versatile cultura alla schermata per i pazienti eleggibili come pure droghe romanzo chaperoni farmacologici.
Abstract
L’uso della medicina personalizzata per il trattamento di malattie monogeniche rare come disturbi connessi all’accumulo lisosomiale (LSD) è sfidato da disegni di trial clinici complessi, costi elevati e basso numero di pazienti. Centinaia di alleli mutanti è implicati nella maggior parte delle malattie da accumulo lisosomiale. Le malattie sono in genere classificate in 2 o 3 tipi clinici differenti secondo la severità. Inoltre, caratterizzazione molecolare del genotipo può aiutare a predire gli esiti clinici e informare la cura del paziente. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un saggio di cultura cellulare semplice basato su cellule HEK293H heterologously che sovraesprimono le mutazioni identificate nella malattia di Fabry e Pompe. Un dosaggio simile recentemente è stato introdotto come un test preclinico per identificare mutazioni favorevoli per la terapia Chaperone farmacologici (PCT) nella malattia di Fabry. Questo manoscritto descrive un’analisi di cultura cellulare modificato che consente la rapida valutazione fenotipica delle varianti alleliche nella malattia di Fabry e Pompe per identificare i pazienti eleggibili per PCT e può essere di aiuto nello sviluppo del romanzo pharmacochaperones.
Introduction
Ci sono oltre una dozzina i disordini da accumulo lisosomiale (LSD) legati alla disfunzione di glycosidase come conseguenza delle mutazioni di gene primario. In Fabry (OMIM #301500) e malattia di Pompe (OMIM #232300), più di 500 e 200 mutazioni di senso sbagliato sono stati segnalati1,2,3 , rispettivamente, che corrisponde a circa il 60% del conteggio totale mutazione. Numerose nuove varianti del gene ancora stanno identificandi, molte delle quali hanno ignoto significato. I vasti studi biochimici hanno rivelato che alcuni genotipi non conducono ad una completa perdita di funzione del gene GLA (OMIM * 300644) nella malattia di Fabry, ma causare l’enzima corrispondente a non riuscire a raggiungere uno stato termodinamicamente favorito pieghevole4 . Ciò provoca ritenzione di ER e degradazione prematura dell’enzima altrimenti funzionale. Simili conclusioni sono state tratte in altre malattie da accumulo lisosomiale, tra cui Pompe malattia5. Inoltre, caratterizzazione molecolare delle varianti di enzima può facilitare l’interpretazione clinica delle mutazioni al momento della diagnosi6, suggerendo che la progressione di LSD è un processo individuale sulla base della natura della mutazione. Di conseguenza, la classificazione convenzionale in diversi tipi clinici in genere 2 o 3 dovrebbe essere rivalutata al fine di ottimizzare la consulenza clinica e le decisioni terapeutiche.
Enzimatica sostitutiva (ERT) è disponibile per entrambe le malattie. ERT, tuttavia, ha limitato l’efficacia nei tessuti/organi colpiti come il cervello e muscolo scheletrico. Inoltre, ERT può suscitare una risposta immunogenica che compromette i suoi benefici terapeutici. Chaperoni farmacologici (pz) sono un’alternativa attraente di trattamento per i pazienti con mutazioni reattive cosiddette. Pz servire come un’impalcatura molecolare per la piegatura della proteina corretta e stabilizzazione che a sua volta impedisce la ritenzione del reticolo endoplasmatico (ER) ed ER-collegata di degradazione dell’enzima. Inoltre, il PC può essere somministrato per via orale e sono potenzialmente in grado di attraversare la barriera ematoencefalica. Di conseguenza, PCT potrebbe essere un’opzione più praticabile per il trattamento di pazienti con determinati genotipi. Per un’ampia rassegna su applicazione PC nelle malattie da accumulo lisosomiale, consultare l’eccellente recensione di Parenti7.
La scoperta di centinaia di malattia che causa gli alleli del mutante sfida test anti-droga pre-clinica e richiede una valutazione semplice, veloce e altamente standardizzata dei pazienti suscettibili di un approccio di medicina personalizzata. Al fine di valutare gli effetti nocivi delle mutazioni di gene di LSD e di testare le mutazioni candidato per predire i pazienti suscettibili per PCT, è stato un sistema altamente standardizzati over-espressione in cellule di HEK293H che consente la misurazione dell’attività dell’enzima veloce e affidabile sviluppato. Sistemi simili di sovra-espressione precedentemente sono stati descritti per la malattia di Fabry e Pompe utilizzando COS-78,9,10,11, HeLa cellule12o HEK29313 ,14,15,16 celle per il gene di glicosidasi.
Un metodo molto simile è stato brevettato anche come un “metodo per predire la risposta al trattamento farmacologico Chaperone di malattie”17 che indica la pertinenza di una cella cultura sistema in grado di essere integrati nella pratica clinica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto nel presente documento fornisce risultati affidabili per la valutazione dei danni degli enzimi in malattie lisosomiali ereditarie del metabolismo. Questo manoscritto è che un emendamento al protocollo pubblicato precedenti15. Le modifiche più cruciale coinvolgono stringenza (cioè, nel processo di preparazione del costrutto di mutante vettoriale), standardizzazione del protocollo di cultura di cellule (cioè, condizioni di manutenzione e di transfezione …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desidera ringraziare Mandy Loebert e Tina Czajka per supporto tecnico eccellente. Ringraziamo Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) per la lingua modifica Guida.
Materials
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
| Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
| Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
| Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
| Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
| GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
| Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
| Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
| water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
| Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
| Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
| Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
| CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
| Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
| BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = not applicable |
Riferimenti
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