再現性の高い、高速、かつ効率的に薬理学的シャペロンと呼ばれる「オーファン」薬の新規クラスのテスト前臨床をする需要があります。新規の薬理学的シャペロン薬と同様に、対象となる患者の画面に、高度に標準化、シンプルで汎用性の高い細胞培養技術を用いた試験を行った。
複雑な臨床試験デザイン、コストが高い、低い患者数でリソソーム貯蔵障害 (Lsd) のようなまれなイネの病気を治療するために個人化された薬の使用に挑戦します。何百もの突然変異体の対立遺伝子は、Lsd のほとんどに関与しています。病気は重症度に応じて異なる臨床型を 2、3 に普通分類されます。さらに、遺伝子型の解析は臨床転帰を予測し、患者のケアに通知を助けることができます。そこで、クローン ファブリとポンペ病の突然変異を過剰発現する HEK293H 細胞に基づく単純な細胞培養の試金。似たようなアッセイは、ファブリー病の従順な変異の薬理学的シャペロン療法 (PCT) を識別するために臨床試験として最近導入されています。本稿では、PCT の対象患者を識別するファブリとポンペ病の allelic 変形の迅速な形質の評価を可能にする新規 pharmacochaperones の開発に役立つ可能性があります修正された細胞培養の試金について説明します。
1 ダース ライソゾーム疾患 (Lsd) に関連する主な遺伝子の突然変異の結果として各種グリコシダーゼ機能不全があります。ファブリ (OMIM #301500)、ポンペ (OMIM #232300) 病、1,2,3が報告されている以上 500 と 200 のミスセンス変異で、それぞれ総突然変異数の約 60% に対応します。多数の新しい遺伝子の変形はまだ識別されている、多くの未知の意義。広範な生化学的研究で明らかにGLA遺伝子の完全な損失関数に-に特定の遺伝子がつながらない (OMIM * 300644) ファブリー病が熱力学的に支持された折りたたみ状態4 に到達する失敗に対応する酵素が発生.これは、結果、ER 保存、関数的な酵素の低下を引き起こす。同様の結論は、ポンペ病5を含む他の Lsd で描かれています。さらに、分子酵素変異株については、診断の6LSD の進行が突然変異の性質に基づいて個々 のプロセスであることを示唆している時に突然変異の臨床的な解釈を促進できます。したがって、従来通常 2、3 の異なる臨床型分類は臨床カウンセリングと治療方針の決定を合理化するために再評価されるべき。
酵素補充療法 (ERT) は両方の病気です。ERT はただし、脳や骨格筋などの影響を受ける組織/臓器の効力を制限されています。また、専門家レビュー チームは、その治療効果を損ないます免疫原性の応答を引き出すことができます。薬理学的シャペロン (Pc) は、いわゆる応答性遺伝子変異を有する患者のための魅力的な治療法代わりです。Pc は正しいタンパク質フォールディングと順番防ぐ小胞体 (ER) の保持と小胞体関連分解酵素の安定化のための分子足場として機能します。また、Pc は経口的に投与することができます、可能性のある血液脳関門を通過することができます。したがって、PCT は、特定の遺伝子を持つ患者を治療するためのより現実的なオプションかもしれません。Lsd で PC アプリケーションの広範なレビュー、Parenti7によって優秀なレビューを参照してください。
何百もの突然変異体の対立遺伝子を引き起こす病気の発見は、前臨床薬物検査に挑戦し、従順な患者個別化医療のアプローチのための単純な高速で、高度に標準化された評価が必要になります。LSD 遺伝子突然変異の有害な影響を評価するために、PCT の従順な患者を予測する候補者突然変異をテストするのには、高速かつ信頼性の高い酵素活性測定できる HEK293H 細胞で過剰発現の高い標準化されたシステムだった開発しました。同様の過剰発現システムは、ファブリとポンペ病 COS 78,9,10、11、HeLa 細胞12HEK293 のいずれかを使用して以前記載されている13 ,14,15,16糖加水分解遺伝子の細胞。
非常に同じような方法は「疾患の薬理学的シャペロン治療へ反応を予測する方法」として特許を取得されても17セルの関連性を示す文化システム臨床実践に統合されることができます。
記載プロトコルは、代謝の遺伝性ライソゾーム病の酵素損傷評価のための強力な結果を提供します。この原稿は、議定書の改正発行以前15です。最も重要な変更を伴う逼迫 (すなわち、ベクター構築準備の過程で)、(すなわち、HEK293H 細胞のメンテナンス、トランスフェクション条件)、細胞培養のプロトコル、高の標準化結果の再現性に著しく貢献した実験繰り?…
The authors have nothing to disclose.
著者は、優れたテクニカル サポートのマンディ Loebert とティナの Czajka を認めたいと思います。編集のヘルプ言語ありがとうフローラ羅 (ハーバード大学医学部、ボストン、マサチューセッツ州、米国)。
Material | |||
QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
Abbreviations | |||
frw = forward; rev = reverse | |||
n.a. = not applicable |