생체 외에서 Fabry에 Pompe 질병 테스트 약리 보호자 응답성을 효소 측정

Summary

전 임상 재현, 빠르고, 효율적인 약리 보호자를 호출 하는 “고아” 약물의 소설 클래스에 대 한 테스트 있도록 수요가 있다. 우리 소설 약리 보호자 약물으로 서 적격 환자에 대 한 간단 하 고, 고도로 표준화, 다양 한 세포 문화 기반 분석 결과 화면을 개발 했다.

Abstract

Lysosomal 저장 장애 (LSDs) 같은 희귀 monogenic 질병을 치료 하는 맞춤된 의학의 사용은 복잡 한 임상 시험 디자인, 높은 비용 및 낮은 환자 수에 의해 도전을 했습니다. 수백 개의 돌연변이 체 대립 유전자는 LSDs의 대부분에 연루 됩니다. 질병은 일반적으로 심각도 따라 2 ~ 3 가지 임상 유형으로 분류 됩니다. 또한, 유전자 형의 분자 특성 임상 결과 예측 하 고 환자 치료를 알릴 수 있습니다. 따라서, 우리는 heterologously-Fabry Pompe 질병에서 확인 된 돌연변이 표현 하는 HEK293H 세포에 따라 간단한 셀 문화 분석 결과를 개발 했다. 유사한 분석 결과 최근 Fabry 질병에 의무가 돌연변이 약리 보호자 치료 (에서 PCT)에 대 한 식별 하기 위해 전 임상 시험으로 도입 되었습니다. 이 원고는 PCT에 대 한 적격 환자 식별 Fabry Pompe 질병 유전자 이체의 신속한 phenotypic 평가 하 고 새로운 pharmacochaperones의 개발에 도움이 있습니다 개정된 셀 문화 분석 결과를 설명 합니다.

Introduction

12 lysosomal 저장 장애 (LSDs) 기본 유전자 변이 결과로 glycosidase 장애에 관련 된 이상 있다. Fabry (OMIM #301500) 병과 Pompe (OMIM #232300),^1,2,3 보고 되었습니다, 이상의 500와 200 missense 돌연변이에 각각,는 총 변이 수의 약 60%에 해당 합니다. 수많은 새로운 유전자 이체는 아직도 확인 되 고, 많은 알 수 없는 의미. 광범위 한 생 화 확 적인 연구 공개 완전 한 손실-의-함수에 GLA 유전자의 특정 genotypes 지도 하지 않는다 (OMIM * 300644) Fabry 질병에 발생 하지만 열역학으로 호의 보인 접는 상태가^{4 실패 해당 효소} . ER 보존과 달리 기능적인 효소의 조 저하 발생합니다. 유사한 결론 Pompe 질병⁵를 포함 하 여 다른 LSDs에 그려 왔다. 또한, 효소 이체의 분자 특성 진단⁶, LSD 진행은 돌연변이의 특성에 따라 개별 과정 제안 시 변이의 임상 해석을 촉진 수 있습니다. 따라서, 임상 상담 및 치료 결정을 합리화 하기 위해서는 일반적으로 2 ~ 3 가지 임상 유형으로 기존의 분류를 재평가 해야 합니다.

효소 대체 요법 (ERT)는 두 질병 수 있습니다. 그러나, ERT, 두뇌와 골격 근육 등 영향을 받는 조직/장기에서 효능을 제한 했다. 또한, ERT의 치료 혜택을 위태롭게 하는 면역성 응답을 유도 수 있습니다. 약리학 보호자 (Pc)는 소위 응답 돌연변이 가진 환자에 대 한 매력적인 치료 대안 이다. Pc는 올바른 단백질 폴딩 및 차례로 바인딩과 그물 (응급실) 보존 및 응급실 관련 효소의 저하를 방지 하는 안정화에 대 한 분자 비 계 역할을 합니다. 또한, Pc 구두로 관리 될 수 있습니다 그리고 잠재적으로 혈액 뇌 장벽을 교차 수 있습니다. 따라서, PCT에 특정 genotypes 가진 환자를 치료를 위한 더 실행 가능한 옵션이 있을 수 있습니다. LSDs 응용 프로그램 PC에 광범위 한 검토를 위해 Parenti⁷에 의해 우수한 검토를 참조 하십시오.

질병을 일으키는 돌연변이 체 대립 유전자의 수백의 발견 전 임상 약물 테스트에 도전 하 고 맞춤된 의학 접근에 대 한 의무가 환자가의 간단 하 고 빠른, 매우 표준화 된 평가 필요로. LSD 유전자 돌연변이의 해로운 효과 평가 하 고 예측 PCT에 대 한 의무가 환자 후보 돌연변이 테스트, 신속 하 고 신뢰할 수 있는 효소 활동 측정 허용 하는 HEK293H 세포에 매우 표준화 초과 식 시스템은 개발. 유사한 이상 식 시스템 이전 COS-7^8,,910,11, HeLa 세포¹²또는 HEK293 Fabry Pompe 질병에 대 한 설명 되었습니다^{13 ,14,,1516} 셀 glycosidase 유전자에 대 한.

아주 유사한 방법도 약리 보호자 질병의 치료에 대 한 응답을 예측 하는 “방법”으로 특허 되었습니다¹⁷ 셀의 관련성을 나타내는 문화 시스템 임상 연습으로 통합 되 고.

Protocol

1. 준비의 돌연변이 pcDNA3.1/GLA와 pcDNA3.1/GAA 구문 참고: GLA 와 GAA 코딩 시퀀스 (cd)에 대 한 복제 전략 보고 이전15,18되었습니다. 사이트 감독 Mutagenesis 사이트 지시 된 Mutagenesis를 사용 하 여 참조를 사용 하 여 시퀀스 NM_000169.2 및 NM_000152.4 mutagenesis GLA 와 GAA 유전자의에 대 한 템플?…

Representative Results

Mutagenesis 절차GLA 유전자 mutagenesis의 효율성을 평가 하는 돌연변이 다음 범주 중 하나로 분류 되었다. 이 방법은 돌연변이 생성 하는 GLA 돌연변이의 66.5%에 대 한 첫 번째 시도에서 가져온 밝혔다. 약간 수정 된 두 번째 PCR 후 추가 25%를 얻을 수 있습니다. 카테고리 1:는 mutagenesis PCR 첫 번째 시도에서 ?…

Discussion

여기에 설명 된 프로토콜 대사의 유전 lysosomal 질병의 효소 손상 평가 대 한 강력한 결과 제공 합니다. 이 원고는 프로토콜 개정 출판 이전¹⁵입니다. 가장 중요 한 수정 포함 엄중 (즉, 돌연변이 벡터 구축 준비 과정), 세포 문화 프로토콜 (즉, HEK293H 셀 유지 보수 및 transfection 조건), 그리고 높은의 표준화 결과의 재현성에 매우 공헌한 실험 반복 (적어도 5)의 수입니다. ?…

Materials

Material
QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit	Stratagene, La Jolla, CA, USA	#200522
Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.
Tryptone	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8952.1
Yeast Extract	Merck, Darmstadt, Germany	103,753
Sodium chloride	Merck, Darmstadt, Germany	1,064,041,000
Potasium chloride	Merck, Darmstadt, Germany	1,049,360,500
MgCl2 x 6H2O	Merck, Darmstadt, Germany	1,058,330,250
D (+)-Glucose monohydrate	Merck, Darmstadt, Germany	1,083,422,500
Sodium Hydroxide	Merck, Darmstadt, Germany	1,064,980,500
Glycine	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	3908.2
Citric acid	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	X863.3
disodium hydrogen phosphate	Merck, Darmstadt, Germany	1,065,860,500
Sodium acetate	Merck, Darmstadt, Germany	1,062,640,050
Glacial acetic acid	Sigma Aldrich, Munich, Germany	A6283
LB Agar	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	X969.2
LB Medium	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	X968.2
Zyppy Plasmid Miniprep Kit	ZymoResearch, Freiburg, Germany	D4020
QIAfilter Plasmid Midi Kit	Qiagen, Hilden, Germany	12245
HEK293H cell line	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	11631-017
Dulbecco´s Modified Eagle Medium	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	31966-047
HyClone fetal bovine serum	GE Healthcare, South Logan, Utah, USA	SV30160.03
Penicillin/streptomycin	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	15140-122
CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One	VWR International GmbH, Hannover, Germany	82050-854
Cell culture plates (24 well)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	831,836
Cellstar 96 well plate	Greiner bio one, Frickenhausen, Germany	655185
SafeSeal reaction tubes, 1,5mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72,706
Lipofectamine 2000	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	11668-019
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride	Sigma Aldrich, Munich, Germany	D9641
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride	Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada	D236500
1-Deoxynojirimycin	Sigma Aldrich, Munich, Germany	D9305
PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium	Biochrom, Berlin, Germany	L 1825
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Scientific, Braunschweig, Germany	25300054
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific, Braunschweig, Germany	23225
4-Methylumbelliferone	Sigma Aldrich, Munich, Germany	M1381
4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside	Sigma Aldrich, Munich, Germany	M7633
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside	Sigma Aldrich, Munich, Germany	M9766
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
incubator type T6	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	n.a.
Luminous Plate Gr. 2 E	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	P265.1
3130 xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems, Darmstadt, Germany	n.a.
GFL-3032 bacterial shaker	GFL, Burgwedel, Germany	n.a.
Avanti J-25 centrifuge	Beckman/Coulter, Krefeld, Germany	n.a.
Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer	Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom	n.a.
water-jacket incubator	Binder, Tuttlingen, Germany	n.a.
Vortex Genie 1 touch mixer	Scientific Industries, Bohemia, NY, USA	n.a.
Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge	Hermle, Tuttlingen, Germany	n.a.
LaboStar ultrapure water device	Siemens, Berlin, Germany	n.a.
Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker	Biosan, Riga, Latvia	n.a.
Tecan GENios Reader	Tecan, Männedorf, Switzerland	n.a.
HI 223 Microprocessor pH Meter	HANNA Instruments, Arvore, Portugal	n.a.
CASY Cell Counter + Analyser System Model TT	Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Magellan data analysis software v6.6	Tecan, Männedorf, Switzerland	n.a.
GraphPad Prism 5.04	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA	n.a.
Microsoft Office 2010	Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA	n.a.
BioEdit Alignment Editor, V7.0.1	http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html	n.a.
Abbreviations
frw = forward; rev = reverse
n.a. = not applicable