In Vitro Enzima de medição para teste farmacológico acompanhante receptividade em Fabry e a doença de Pompe
Summary
Há uma demanda para fazer pré-clínicos de teste para uma novela classe de drogas “órfão” chamado acompanhantes farmacológicos podem ser reproduzidos, rápido e eficiente. Desenvolvemos um ensaio de baseado em cultura celular altamente padronizado, simples e versátil para tela para pacientes elegíveis, bem como drogas de romance acompanhante farmacológica.
Abstract
O uso da medicina personalizada para tratar doenças monogénicas raras como doenças de depósito lisossômico (DDL) é desafiado por projetos complexos de julgamento clínicos, custos elevados e baixos números de paciente. Centenas de alelos mutantes estão implicadas na maior parte a DDL. As doenças geralmente são classificadas em 2 ou 3 diferentes tipos clínicos de acordo com a gravidade. Além disso, a caracterização molecular do genótipo pode ajudar a prever os resultados clínicos e informar o atendimento ao paciente. Portanto, nós desenvolvemos um ensaio de cultura de células simples baseado em células HEK293H heterologously over expressando as mutações identificadas na doença de Fabry e Pompe. Um ensaio semelhante foi recentemente introduzido como um teste pré-clínicos para identificar mutações favoráveis para a terapia farmacológica de acompanhante (PCT) na doença de Fabry. Este manuscrito descreve um ensaio de cultura de célula alterada que permite rápida avaliação fenotípica de variantes alélicas na doença de Fabry e Pompe para identificar pacientes elegíveis para PCT e pode ajudar no desenvolvimento do romance pharmacochaperones.
Introduction
Há dúzias de desordens de doenças de depósito lisossômico (DDL) relacionados a disfunção glicosidase como resultado de mutações do gene principal. Em Fabry (OMIM #301500) e a doença de Pompe (OMIM #232300), mais de 500 e 200 mutações missense1,2,3 têm sido relatadas, respectivamente, que corresponde a cerca de 60% da contagem total de mutação. Numerosas novas variantes do gene ainda estão sendo identificadas, muitos dos quais têm desconhecido significado. Extensos estudos bioquímicos revelaram que certos genótipos não conduziu a uma completa perda de função do gene ABL (OMIM * 300644) na doença de Fabry, mas causam a enzima correspondente a falha alcançar um estado de dobramento termodinamicamente favorecido4 . Isso resulta em retenção de ER e degradação prematura da enzima funcional caso contrário. Conclusões similares foram desenhadas em outros LSDs, incluindo a doença de Pompe5. Além disso, caracterização molecular das variantes da enzima pode facilitar a interpretação clínica das mutações no momento do diagnóstico6, sugerindo que a progressão de LSD é um processo individual, com base na natureza da mutação. Portanto, a classificação convencional em diferentes tipos clínicos normalmente de 2 a 3 deve ser reavaliada a fim de racionalizar o aconselhamento clínico e decisões terapêuticas.
Terapia de reposição enzimática (ERT) está disponível para ambas as doenças. ERT, no entanto, tem limitada eficácia em tecidos/órgãos afetados como o cérebro e o músculo esquelético. Além disso, a ERT pode eliciar uma resposta imunogênica que coloca em risco seus benefícios terapêuticos. Acompanhantes farmacológicas (PCs) são uma alternativa atraente de tratamento para pacientes com mutações responsivos so-called. PCes servem como um andaime molecular para proteínas correto e estabilização que por sua vez impede a retenção de retículo endoplasmático (ER) e ER-associado a degradação da enzima. Além disso, PCs podem ser administrados por via oral e são potencialmente capazes de atravessar a barreira hemato-encefálica. Portanto, o PCT pode ser uma opção mais viável para o tratamento de pacientes com determinados genótipos. Para uma extensa revisão sobre aplicação de PC em DDL, consulte a excelente revisão por Parenti7.
A descoberta de centenas de doenças causando alelos mutantes desafia testar da droga do pre-clínica e exige uma avaliação simples, rápida e altamente padronizada de pacientes passíveis de uma abordagem de medicina personalizada. A fim de avaliar os efeitos nocivos de mutações do gene de LSD e testar mutações candidato para predizer pacientes passíveis de PCT, era um sistema de sobre-expressão altamente padronizados em células HEK293H que permite a medição de atividade enzimática rápida e confiável desenvolvido. Sistemas de sobre-expressão semelhantes têm sido descritos anteriormente para a doença de Fabry e Pompe com COS-78,9,10,11, de células HeLa12ou HEK29313 ,14,15,16 células para o gene glicosidase.
Um método muito semelhante mesmo foi patenteado como “Método para predizer a resposta ao tratamento farmacológico acompanhante de doenças”17 , indicando a relevância de uma célula de cultura sistema capaz de ser integrada na prática clínica.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito neste documento proporciona resultados robustos para avaliação dos danos da enzima em doenças lisossômicas hereditárias do metabolismo. Este manuscrito é que uma alteração do protocolo publicado anteriores15. As modificações mais cruciais envolvem rigor (ou seja, no processo de preparação de construção vector mutante), padronização do protocolo de cultura de célula (ou seja, as condições de manutenção e transfecção de células HEK293H) …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores que gostaria de agradecer a Mandy Loebert e Tina Czajka por excelente suporte técnico. Agradecemos a Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, EUA) para o idioma de edição ajuda.
Materials
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
| Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
| Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
| Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
| Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
| GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
| Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
| Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
| water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
| Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
| Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
| Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
| CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
| Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
| BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = not applicable |
Riferimenti
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