In Vitro Medición de la enzima a prueba chaperonas farmacológicas respuesta de Fabry y la enfermedad de Pompe
Summary
Existe una demanda para hacer clínico pruebas de una nueva clase de fármacos “huérfanos” llamadas chaperonas farmacológicas reproducible, rápida y eficiente. Desarrollamos un análisis basado en la cultura de célula simple, altamente estandarizados y versátil a pantalla para pacientes elegibles así como chaperonas farmacológicas novela drogas.
Abstract
El uso de la medicina personalizada para tratar enfermedades monogénicas raras como trastornos de depósito lisosomal (LSDs) es desafiado por diseños de ensayos clínicos, altos costos y bajo número de pacientes. Cientos de alelos del mutante están implicados en la mayoría de los LSDs. Las enfermedades se clasifican típicamente en 2 a 3 diferentes tipos clínicos según la gravedad. Por otra parte, la caracterización molecular del genotipo puede ayudar a predecir los resultados clínicos e informar a la atención de los pacientes. Por lo tanto, hemos desarrollado un ensayo de cultivo de célula simple basado en HEK293H las células con heterologously sobreexpresión las mutaciones identificadas en la enfermedad de Fabry y Pompe. Un análisis similar se ha introducido recientemente como prueba preclínica para identificar mutaciones susceptibles de terapia farmacológica de acompañante (PCT) en la enfermedad de Fabry. Este manuscrito describe un ensayo de cultivo de células modificadas que permiten una rápida evaluación fenotípica de variantes alélicas en la enfermedad de Fabry y Pompe a identificar a los pacientes elegibles para el PCT y puede ayudar en el desarrollo de nuevos pharmacochaperones.
Introduction
Hay más de una docena trastornos de lysosomal del almacenaje (LSDs) relacionados con la disfunción glucosidasa como resultado de mutaciones en el gen primario. Fabry (OMIM #301500) y la enfermedad de Pompe (OMIM #232300), más de 500 y 200 mutaciones sin sentido ha informado de1,2,3 , respectivamente, que corresponde a cerca del 60% de la cuenta total mutación. Numerosas nuevas variantes de genes todavía están siendo identificadas, muchos de los cuales tienen desconocido significado. Estudios bioquímicos revelaron que ciertos genotipos no conducen a una pérdida de función completa del gen GLA (OMIM * 300644) en la enfermedad de Fabry, pero hacer que la enzima correspondiente para no llegar a un estado plegado termodinámicamente favorecido4 . Esto resulta en retención de ER y degradación prematura de la enzima funcional de lo contrario. Conclusiones similares han sido elaborados en otras LSDs como Pompe enfermedad5. Por otra parte, la caracterización molecular de las variantes de la enzima puede facilitar la interpretación clínica de las mutaciones en el momento del diagnóstico6, sugiriendo que la progresión de la LSD es un proceso individual basado en la naturaleza de la mutación. Por lo tanto, la clasificación convencional en diferentes tipos clínicos típicamente de 2 a 3 debe ser reevaluada para optimizar el asesoramiento clínico y decisiones terapéuticas.
La terapia de reemplazo de la enzima (ERT) está disponible para ambas enfermedades. ERT, sin embargo, ha limitado eficacia en tejidos/órganos afectados como cerebro y músculo esquelético. Además, ERT puede provocar una respuesta inmunogénica que ponga en peligro sus beneficios terapéuticos. Chaperonas farmacológicas (PC) son una alternativa de tratamiento atractiva para los pacientes con mutaciones sensibles supuestos. PC sirve como un andamio molecular para el plegamiento de la proteína correcta y estabilización que a su vez impide la retención del retículo endoplásmico (ER) y ER-asociados de degradación de la enzima. Además, el PC puede administrarse por vía oral y es potencialmente capaces de cruzar la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, la PCT puede ser una opción más viable para el tratamiento de pacientes con ciertos genotipos. Una extensa revisión sobre la aplicación de PC en LSDs, consulte la excelente revisión por Parenti7.
El descubrimiento de cientos de enfermedades que causan alelos del mutante desafía a pruebas de drogas clínico previo y requiere una evaluación sencilla, rápida y altamente estandarizada de pacientes susceptibles de un enfoque de la medicina personalizada. Con el fin de evaluar los efectos perjudiciales de las mutaciones de gene de LSD y probar mutaciones del candidato para predecir a pacientes susceptibles para el PCT, era un sistema altamente estandarizados sobreexpresión en células HEK293H que permite la medición de la actividad enzimática rápida y fiable desarrollado. Sistemas de expresión similares se han descrito previamente para la enfermedad de Fabry y Pompe con COS-78,9,10,11, HeLa células12o HEK29313 ,14,15,16 células para el gen de la glucosidasa.
Un método muy similar incluso ha sido patentado como “Método para predecir la respuesta al tratamiento farmacológico acompañante de enfermedades”17 que indica la relevancia de una célula sistema capaz de integrarse a la práctica clínica de la cultura.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito en el presente documento ofrece resultados robustos para la evaluación de daños de la enzima en enfermedades lisosomales hereditarias del metabolismo. Este manuscrito es que una enmienda al protocolo publicado anterior15. Las modificaciones más importantes implican rigor (es decir, en el proceso de preparación de construcción de vector mutante), normalización del Protocolo de la cultura de célula (es decir, las condiciones de mantenimiento y transfecc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer la Loebert Mandy y Tina Czajka excelente soporte técnico. Agradecemos Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) lengua ayuda de edición.
Materials
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
| Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
| Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
| Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
| Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
| GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
| Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
| Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
| water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
| Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
| Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
| Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
| CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
| Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
| BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = not applicable |
Riferimenti
- Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
- Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
- Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
- Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
- Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
- Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331 (2008).
- Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66 (2011).
- Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092 (2014).
- Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
- Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
- Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
- Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632 (2013).
- Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
- . Available from: https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017)
- Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
- Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
- Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
- Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
- Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
- Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111 (2013).
- Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
- Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91 (2012).
- Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
- Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
- Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).
