Anvendelse af Aorta-gonade-mesonephros eksplantat kultur System i udviklingsmæssige bloddannelsen
Summary
Denne protokol beskriver brug af kulturperler Aorta-gonade-Mesonephros udtryk analyser, kolonidannende enheder i kultur og milt og langsigtede rekonstitution for at bestemme virkningen af lovgivningsmæssige faktorer og signalering veje på hæmatopoietisk stilk celle udvikling. Dette er blevet bevist som en effektiv ordning for at studere hæmatopoietisk stamcelle biologi og funktion.
Abstract
Begrænsning af ved hjælp af musen embryoner for bloddannelsen undersøgelser er tilføjet besværet i operationer, som er i vid udstrækning på grund af intrauterin udviklingen af fosteret. Selv om genetiske data fra knockout (KO) mus er overbevisende, er det ikke realistisk at generere KO mus til alle gener efter behov. Derudover udfører i vivo rescue eksperimenter til at konsolidere resultaterne af KO mus er ikke nem. For at overvinde disse begrænsninger, blev Aorta-gonade-Mesonephros (AGM) eksplantat kultur udviklet som et passende system til at studere hæmatopoietisk stamcelle (HSC) udvikling. Især for redning eksperimenter, kan det bruges til at genoprette den nedsat bloddannelsen i KO mus. Ved at tilføje de relevante kemikalier i mediet, nedsat signalering kan genaktiveres eller op-regulerede veje kan blive hæmmet. Med brugen af denne metode, mange eksperimenter kan udføres for at identificere de kritiske regulatorer af HSC udvikling, herunder HSC relaterede genekspression på mRNA og protein niveauer, koloni dannelse evne og rekonstitution kapacitet. Denne serie af eksperimenter ville være nyttigt at definere de underliggende mekanismer, der er afgørende for HSC udvikling i pattedyr.
Introduction
Hæmatopoietisk stamceller (HSCs) er væv-specifikke voksne stamceller, som besidder multilineage potentiale, herunder erythroid, myeloid, og lymfoide celler samt evnen til at selv forny. Nylige undersøgelser har vist, at de tidligste HSCs opstod fra en specialiseret endotel befolkning, kendt som hemogenic endotelet (han), gennem i endothelial hæmatopoietisk overgangen (EHT) på den ventrale væg af dorsal aorta1,2 ,3,4. Når dannet i aorta-gonade-mesonephros (AGM) region fra embryonale (E) 10.5 til E12.5 i mus embryo, vil HSCs migrere ind i føtal leveren for ekspansion og endelig kolonisere knoglemarven til at opretholde voksen bloddannelsen i hele en persons liv 5 , 6. selv om det har været studeret i mange år, de underliggende mekanismer af HSC fremkomsten og udviklingen fortsat utilstrækkeligt forstået.
I modsætning til in vitro- befrugtning og udvikling af zebrafisk embryoner gør intrauterin udvikling af musen embryoner studiet af endelige bloddannelsen under embryogenese meget mere besværligt. Selv om genetiske eksperimenter ved hjælp af knockout (KO) mus er almindeligvis udnyttet, begrænser manglen på visse KO mus også deres brug i feltet hæmatopoietisk forskning. Desuden, udføres i vivo rescue eksperimenter ikke nemt i KO mus. Siden 1996, er AGM eksplantat kultur blevet udviklet for hæmatopoietisk undersøgelser af pionerer i felt7. Med hjælp fra denne kultur system, er blevet identificeret ventrale væv af AGM-regionen for at fremme HSC aktivitet, mens dorsale væv udøve en modsat effekt8,9. AGM eksplantat kultur-systemet er også blevet anvendt til at bestemme rollerne af Serotonin, Mpl, SCF, BMP og pindsvin signalering i HSC udvikling10,11,12,13, 14. vigtigere, det er også en populær metode til at redde hæmatopoietisk defekter i mutant embryoner13,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er velkendt, at modne HSCs i knoglemarven kan genbefolke blod system af bestrålede modtagere. I modsætning til disse funktionelle HSCs er de nye HSCs i den ordinære generalforsamling af musen embryoner umodne. Direkte transplantation resultater viste, at type jeg (VE-cad+ CD45– CD41+) og type II (VE-cad+ CD45+) pre-HSCs besidder ingen rekonstitution evne20. At drage fordel af generalforsamlingen eksplantat kultur system, de spirende HSC…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Suwei Gao for hjælp i figur forberedelse. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81530004, 31425016) og ministeriet for videnskab og teknologi i Kina (2016YFA0100500). J.L. udført eksperimenter og udarbejdet manuskript; F.L. redigeret håndskriftet. Begge forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.
Materials
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
Riferimenti
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
- Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
- Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
- Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
- Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
- Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
- Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
- Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784 (2016).
- Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
- Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
- Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
- Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
- Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
- Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).
