Questo protocollo descrive l'utilizzo coltivate Aorta-gonade-Mesonephros per analisi di espressione, unità formanti colonia in cultura e milza e ricostituzione a lungo termine per determinare l'effetto di fattori regolatori e vie di segnalazione su staminali ematopoietiche sviluppo delle cellule. Questo è stato dimostrato come un sistema efficace per lo studio della funzione e biologia delle cellule staminali ematopoietiche.
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Articolo metodologico
Applicazione del sistema di coltura Explant Aorta-gonade-Mesonefro nell'ematopoiesi inerente allo sviluppo
In questo articolo
Sommario
Abstract
La limitazione dell'utilizzo di embrioni di topo per studi di ematopoiesi è l'inconveniente aggiunto nelle operazioni, che è in gran parte dovuto lo sviluppo intrauterino dell'embrione. Anche se sono convincenti dati genetici da topi knockout (KO), non è realistico per generare topi KO per i geni tutti come necessario. Inoltre, esibendosi in vivo gli esperimenti di salvataggio per consolidare i dati ottenuti da topi KO non è conveniente. Per superare queste limitazioni, la cultura di espianto Aorta-gonade-Mesonephros (AGM) è stata sviluppata come un sistema appropriato per studiare lo sviluppo di cellule staminali ematopoietiche (HSC). Soprattutto per gli esperimenti di salvataggio, può essere utilizzato per recuperare l'ematopoiesi alterata in topi KO. Con l'aggiunta di prodotti chimici appropriati nel mezzo, la segnalazione alterata può essere riattivata o vie di up-regolato possono essere inibite. Con l'uso di questo metodo, molti esperimenti possono essere eseguite per identificare i regolatori critici dello sviluppo di HSC, compreso HSC correlati espressione genica a livelli di mRNA e proteina, capacità di formazione di Colonia e la capacità di ricostituzione. Questa serie di esperimenti sarebbe utile nel definire i meccanismi di fondo essenziali per lo sviluppo di HSC nei mammiferi.
Introduzione
Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule staminali adulte tessuto-specifici che possiedono multilineare potenziale compreso degli eritrociti, mieloidi e cellule linfoidi come pure la capacità di auto-rinnovarsi. Recenti studi hanno dimostrato che i primi HSCs è sorto da una popolazione endoteliale specializzata, nota come endotelio hemogenic (HE), attraverso l'endoteliale di transizione ematopoietico (EHT) presso la parete ventrale dell'aorta dorsale1,2 ,3,4. Una volta formato regione aorta-gonade-mesonephros (AGM) da embrionali....
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Protocollo
tutte le procedure tra cui animali soggetti sono state approvate dal comitato etico di recensione all'Istituto di zoologia, Accademia delle scienze cinese, Beijing, China.
1. preparazione dei materiali
- sterilizzare il 0,65 µm filtri con raggi ultravioletti raggi prodotti sotto i raggi ultravioletti ray lampada sul banco pulito per 4 h e capovolgere i filtri dopo il segno di 2 h.
Nota: Quando si lavora con luce UV, indossare una protezione appropriata. - Sterilizzare le maglie in acciaio inox con la sterilizzatrice autoclave a 121 ° C per 30 min.
Nota: Una certa altezza della maglia dell'acciaio inossidabile....
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Risultati
Una recente pubblicazione segnalata serotonina derivato da cellule endoteliale promuove la sopravvivenza di HSCs inibendo la via di pro-apoptotica del AGM13. Per confermare l'effetto di promozione della serotonina sullo sviluppo di HSC, Fluoxetine è stato inclusa. Come un inibitore della ricaptazione di serotonina (SSRI), Fluoxetine è stata dimostrata di inibire il riassorbimento di serotonina in tessuti periferici16,
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Discussione
È noto che HSCs maturo nel midollo osseo può ripopolare il sistema sangue di destinatari irradiati. A differenza di questi HSCs funzionale, le HSCs emergenti in AGM degli embrioni del mouse sono immaturi. Risultati di trapianto diretto ha mostrato quel tipo mi (VE-cad+ CD45– CD41+) e tipo II (VE-cad+ CD45+) pre-HSCs possedere nessuna capacità di ricostituzione20. Sfruttando il sistema di coltura explant AGM, il nascente HSCs nella regione AGM .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi finanziario.
Ringraziamenti
Ringraziamo Suwei Gao per aiuto nella preparazione di figura. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Foundation Natural Science of China (81530004, 31425016) e il Ministero della scienza e tecnologia della Cina (2016YFA0100500). J.L. eseguito gli esperimenti e redatto il manoscritto; F.L. modificato il manoscritto. Entrambi gli autori letto ed approvato il manoscritto finale.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| durapore 0,65 µ m filtri | Millipore | R5BA63787 | coltura di espianti AGM |
| terreno di coltura a lungo termine M5300 | Stem Cell Technologies | 5300 | coltura di espianti AGM |
| Trizol | Tiangen | 5829 | Estrazione di RNA |
| M-MLV trascrittasi inversa | Promega | 90694 | trascrizione inversa |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | inibitore quantitativo della proteasi PCR in tempo reale |
| Roche | 55622 | Estrazione proteica | |
| collagenasi | Sigma | C2674 | digestione dei tessuti AGM |
| MethoCult GF M3434 medio | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C test |
| attacco ultra-basso piastre a 24 pozzetti | Costar | 3473 | CFU-C test |
| C57BL/6 CD45.2 topi | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 topi | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Trapianto a lungo termine | |
| soluzione salina tamponata con fosfato | Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | HyClone | SV30010 | Coltura di espianti AGM |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Trapianto a lungo termine |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Lampada UV per trapianto a lungo termine |
| Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | potenza: 30W | |
| maglia in acciaio inossidabile | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | Diametro apertura: 2,5 mm |
| idrocortisone | Sigma | H0396 | diluito selettivamente in terreno M5300 |
Riferimenti
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle.
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Ristampe e permessi
