Aplicación de sistema de cultivo de explantes de Aorta-gónada-mesonefros en hematopoyesis del desarrollo
Summary
Este protocolo describe el uso cultivadas Aorta-gónada-mesonefros para análisis de expresión, unidades formadoras de colonias en la cultura y el bazo y la reconstitución a largo plazo para determinar el efecto de factores reguladores y vías de señalización de vástago de hematopoietic desarrollo de la célula. Esto ha sido demostrado como un sistema eficaz para el estudio de la función y biología de células madre hematopoyéticas.
Abstract
La limitación del uso de embriones de ratón para los estudios de la hematopoyesis es el mayor inconveniente en operaciones, que es en gran parte debido al desarrollo intrauterino del embrión. Aunque los datos genéticos de ratones knockout (KO) son convincentes, no es realista para generar ratones KO para todos los genes según sea necesario. Además, en vivo rescate experimentos para consolidar los datos obtenidos de ratones KO no es conveniente. Para superar estas limitaciones, se desarrolló la cultura de explante de Aorta-gónada-mesonefros (AGM) como un sistema apropiado para el estudio de desarrollo de células madre hematopoyéticas (HSC). Especialmente para los experimentos de rescate, puede utilizarse para recuperar el deterioro de la hematopoyesis en ratones KO. Mediante la adición de los productos químicos adecuados en el medio, la señalización deteriorada puede ser reactivada o vías regulado de arriba pueden ser inhibidas. Con el uso de este método, muchos experimentos para identificar los reguladores críticos de desarrollo de HSC se puede realizar, incluyendo HSC relacionados con la expresión del gen en ARNm y proteínas, capacidad de formación de Colonia y capacidad de reconstitución. Esta serie de experimentos sería útil en la definición de los mecanismos subyacentes esenciales para el desarrollo de HSC en los mamíferos.
Introduction
Las células madre hematopoyéticas (HSCs) son específicas de tejido las células madre adultas que poseen potencial del multilineage incluyendo eritroide, mieloide y linfocitos así como la capacidad de autorrenovación. Estudios recientes han demostrado que las HSCs más tempranas surgieron una población endotelial especializada, conocida como endotelio hemogenic (él), a través endotelial transición hematopoyético (EHT) en la pared ventral de la aorta dorsal1,2 ,3,4. Una vez formados en la aorta-gónada-mesonefros (AGM) región embrionaria (E) 10.5 a E12.5 en el embrión de ratón, HSCs a migrar en el hígado fetal para la expansión y finalmente colonizar la médula ósea para mantener la hematopoyesis durante toda la vida de un individuo adulto 5 , 6. aunque esto ha sido estudiado por muchos años, los mecanismos subyacentes de la aparición de HSC y el desarrollo siguen siendo incompleto entendidos.
A diferencia de la fertilización in vitro y el desarrollo de embriones de pez cebra, desarrollo intrauterino de embriones de ratón hace que el estudio de la hematopoyesis definitiva durante la embriogénesis mucho más incómoda. Aunque comúnmente se utilizan experimentos genéticos con ratones knockout (KO), la falta de ciertos ratones KO también limita su uso en el campo de investigación hematopoyético. Además, los experimentos en vivo rescate no se realizan fácilmente en los ratones KO. Desde 1996, el cultivo de explantes de AGM se ha desarrollado estudios hematopoyéticos por los pioneros en el campo7. Con la ayuda de este sistema de cultivo, se han identificado los tejidos ventrales de la región AGM para promover actividad HSC, mientras que los tejidos dorsales ejercen un efecto opuesto8,9. El sistema de cultivo de explantes AGM también se ha aplicado para determinar el papel de la serotonina, Mpl, SCF, BMP y erizo en HSC desarrollo10,11,12,13, 14. lo importante, es también un método popular usado para rescate hematopoyéticos defectos en embriones mutantes13,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es bien sabido que las HSCs maduras en la médula ósea pueden repoblar el sistema sanguíneo de los receptores irradiados. A diferencia de las HSCs funcionales, las HSCs emergentes en la Junta General de embriones de ratón son inmaduras. Resultados trasplante directo demostraron ese tipo I (VE-cad+ CD45– CD41+) y tipo II (VE-cad+ CD45+) pre-HSCs poseen sin reconstitución capacidad20. Aprovechando el sistema de cultivo de explantes AGM, la…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Suwei Gao ayuda en la preparación de la figura. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la nacional Ciencias naturales Fundación de China (81530004, 31425016) y el Ministerio de ciencia y tecnología de China (2016YFA0100500). J.L. realiza los experimentos y redactó el manuscrito; F.L. había editado el manuscrito. Ambos autores había leído y aprobaron el manuscrito final.
Materials
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
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