Questo studio dimostra l'utilità e la facilità di misurazione estensione quantitativa della membrana cellulare e la sua correlazione alla capacità adesiva delle cellule. Come un esempio rappresentativo, indichiamo qui quella proteina correlata Dickkopf 3 (DKK3) promuove la formazione aumentata lobopodia e adesività delle cellule nel carcinoma corticosurrenale cellule in vitro.
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Articolo metodologico
Caratterizzazione delle estensioni della membrana cellulare e studiando i loro ruoli nella dinamica di adesione delle cellule cancro
In questo articolo
Sommario
Abstract
Repertorio di estensione della membrana cellulare modula vari comportamenti maligni delle cellule tumorali, comprese le potenzialità adesive e migratori. La capacità di classificare e quantificare le estensioni delle cellule con precisione che misura l'effetto sulla capacità adesiva di una cella è fondamentale per determinare come cellula-segnalazione eventi impatto cancro cella comportamento e aggressività. Qui, descriviamo in vitro progettazione e l'uso di un cella quantificazione metodo di estensione in combinazione con un'analisi di capacità di adesione a un modello stabilito in vitro per carcinoma corticosurrenale (ACC). In particolare, ci prova gli effetti di DKK3, un oncosoppressore putativo e un fattore di pro-differenziazione, il fenotipo di membrana estensione della linea cellulare ACC, SW-13. Vi proponiamo queste analisi per fornire relativamente semplice, affidabile e facilmente interpretabili metriche di misura queste caratteristiche nelle varie circostanze sperimentali.
Introduzione
Dysregulated WNT segnalazione svolge un ruolo critico nella malignità corticosurrenale1. I metodi utilizzati in questo studio studiare se il silenziamento di DKK3, un regolatore negativo di segnalazione WNT, rappresenta un evento di dedifferenziazione nella corteccia surrenale e promuove la formazione del tumore nel contesto dei cambiamenti del repertorio di cella-estensione. DKK3 è un 38 kDa secreto glicoproteina con un peptide segnale N-terminale e gli studi precedenti hanno dimostrato che la sua espressione forzata provocato l'arresto del ciclo cellulare, ha inibito il comportamento maligno aggressivo e invertito epiteliale-mesenchimale pass....
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Protocollo
1. cella estensione caratteristiche
- Mantenere SW-13, SW-Neo e cellule SW-DKK3 in un incubatore umidificato standard a 37,0 ° C e 5% CO2 nel Medium di Eagle di Dulbecco per volta completati con 10% siero bovino fetale e 10.000 U/mL di penicillina e streptomicina (designato come 'crescita medio').
- Contare le celle utilizzando un emocitometro e piastra 5.000 cellule per pozzetto per SW-13, SW-Neo e SW-DKK3 linee in separata piastre da 6 pozzetti e crescere durante la notte nel mezzo di crescita sulle lamelle di vetro sterile.
- Dopo la crescita durante la notte, per ogni bene, aspirare il mezzo di crescita, lavare le cell....
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Risultati
Utilizzando le analisi di cui sopra, gli effetti dell'iperespressione di DKK3 sulla morfologia delle cellule estensione e proprietà di adesione delle cellule sono stati testati nella linea cellulare ACC stabilita SW-13, in vitro. Cellule che overexpressing DKK3 sono state generate da trasfezione stabile SW-13 celle con Myc-DDK taggati pCMV6-voce/DKK3 plasmide vettori e designato come SW-DKK3. Allo stesso modo, cellule trasfettate stabilmente con il vettore vuoto pCMV6-voce sono s.......
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Discussione
Qui descriviamo un metodo quantitativo in vitro per caratterizzare le estensioni delle cellule con facilità, pochi pit-cade e riproducibilità affidabile che può essere applicato per diverse condizioni di test. Inoltre, semplice, quantificabili saggi di adesione e/o motilità possono essere eseguite simultaneamente per correlare il potenziale significato funzionale delle alterazioni osservate nelle estensioni della membrana cellulare.
Tuttavia, questi metodi possono presentare alcune li.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ohse Grant della Fondazione finanziato quest'opera.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Integrato con siero fetale bovino e penicllina e streptomicina |
| salina tamponata con fosfato di Deulbeco | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X, utilizzata direttamente |
| 3,7% di formaldeide | Sigma-Aldrich | F8775 | Soluzione madre diluita |
| 0,05% cristallovioletto | Harleco | 192-12 | Soluzione madre diluita |
| Microscopio NA | NA | NA | con acqua deionizzata |
| con ingrandimento 400X | NA | NA | |
| Piastre a 6 pozzetti | Corning | 353046 | NA |
| Soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | Soluzione 1X, utilizzata direttamente |
Riferimenti
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Bioch....
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Ristampe e permessi
