تتحرك صعودا: بسيطة ومرنة في المختبر غزو ثلاثية الأبعاد مقايسة بروتوكول
Summary
ويصف هذا البروتوكول مقايسة غزو عمودي مقلوب التي يمكن أن تستخدم لقياس قدرات الهجرة وغزو الخلايا في أجواء ثلاثية الأبعاد مع الحفاظ على المكروية الخلية. هذا التحليل مناسبة لخلايا نادرة و/أو الحساسة.
Abstract
على الرغم من أن قد وضعت فحوصات غزو 3D، يظل التحدي هو دراسة الخلايا دون التأثير على سلامة المكروية بهم. فحوصات 3D التقليدية مثل قاعة Boyden تتطلب أن الخلايا المشردين من موقع الثقافة الأصلية ونقلها إلى بيئة جديدة. هذا تعطيل العمليات الخلوية التي متأصلة المكروية، بل أنه كثيرا ما يؤدي إلى فقدان الخلايا. هذه المشاكل تنطوي على تحديات خاصة عند التعامل مع الخلايا التي أما نادرة، أو حساسة للغاية لتلك المكروية. هنا، نحن تصف وضع مقايسة 3D غزو أن يتجنب كل الشواغل. في هذا الفحص، يتم مطلي الخلايا داخل صغيرة جيدا ووضعت مصفوفة إدارة المحتوى في المؤسسة التي تحتوي على تشيمواتراكتانت من فوق الخلايا. هذا يتطلب لا خلية التشرد، ويسمح للخلايا بغزو صعودا في المصفوفة. في هذا التحليل، يمكن تقييم غزو الخلية، فضلا عن مورفولوجيا الخلايا داخل جل الكولاجين. يمكننا استخدام هذا الفحص، تميز الغازية قدرة خلايا نادرة وحساسة؛ الخلايا المختلطة الناتجة عن اندماج بين خلايا سرطان الثدي MCF7 والوسيطة/multipotent الخلايا الجذعية/ستروما (MSCs).
Introduction
خلية حركية عملية إنمائية والفسيولوجية طبيعية من الخلايا. ومع ذلك، تغييرات في النمط وقدرة الخلايا على الهجرة وغزو ترتبط بالحالات المرضية بما في ذلك أمراض التهابات وسرطان خبيث1،،من23. ورم خبيث هو يمكن القول أن الجانب الأكثر غير مفهومة في السرطان. السرطاني، خلايا السرطان يجب أن تتحلل المصفوفة الخلوية إضافية (ECM)، تغزو الأنسجة المحلية وإينترافاساتي. مرة واحدة في الدورة الدموية، والخلايا السرطانية سيتم نشر إلى الموقع البعيد واكسترافاساتي وتشكل الأورام الثانوية. ولذلك، القدرة الخلايا تتحلل إدارة المحتوى في المؤسسة، لترحيل، وغزو مرتبط بامكاناتهم المنتشر. وضعت نهوج مختلفة لتحليل وقياس قدرات الهجرة وغزو الخلايا. وتشمل النهج الأكثر استخداماً الجرح الشفاء المقايسة والوقت الفاصل بين الفحص المجهري والمقايسة الدائرة Boyden. الجرح الشفاء المقايسة4 ووقت مرور الفحص المجهري هي فحوصات بسيطة ومريحة التي سوف تعطي فكرة أولية عن الهجرة الخلية. ومع ذلك، وكلاهما فحوصات 2D لا تعكس البيئة ثلاثية الأبعاد التي توجد فيها الخلايا في الجسم الحي. وقد أظهرت الدراسات أن الخلايا تستجيب بشكل مختلف لبيئة ثلاثية الأبعاد بالمقارنة مع واحد 2D5،6. وعلاوة على ذلك، يصعب فحوصات شفاء الجرح إلى إنتاج وأن تسفر عن نتائج كمية7،،من89. والرزن خلية منطقة الاستبعاد، وتعديل 3D للجرح شفاء المقايسة، تحليل ذات صلة أكثر فسيولوجيا لكن أنها ليست مناسبة للخلايا منخفض في عدد مثل الخلايا المختلطة الناتجة عن خلية الانصهار الأحداث10،11 .
فحص الدائرة Boyden هو فحص ثلاثي الأبعاد الذي يوفر ميكرونفيرونمينتس ذات الصلة للدراسات الخلوية. ومع ذلك، فإنه يتطلب الخلايا المراد إزالتها من على المكروية الأصلي وأن تودع في مجلس الشيوخ نظام مقايسة Boyden لترحيل وغزو نازلا نحو المتوسطة المحتوية على تشيمواتراكتانت. هذا النهج ثلاثي الأبعاد غير المناسبة في تحليل القدرة على الهجرة وغزو الخلايا الضعيفة المكروية و/أو محدودة في عدد10،،من1112. اتباع نهج جديدة لتحليل الهجرة الخلية وغزو هو مقايسة13دائرة التدرج موائع جزيئية. على الرغم من مناسبة وموثوق بها في دراسات الهجرة والغزو، هذا التحليل هو أكثر تكلفة ويمكن أن تكون صعبة من الناحية الفنية لمختبر نموذجي. يصف لنا هنا مقايسة بسيطة غزو عمودي مقلوب هو متوافق مع العديد من أنواع الخلايا بما فيها الخلايا الحساسة لما المكروية و/أو المقيدة في عدد. وكان هذا التحليل مقتبس من البروتوكول المقترح من هوبر وآخرون 14-في هذا التحليل، تبقى الخلايا في بهم المكروية الأصلي وهجرتها ويرصد الغزو كما أنها تتحرك صعودا في جل الكولاجين التي تحتوي على تشيمواتراكتانت11. هذا التحليل استنساخه وقد الأمثل والتحقق من صحتها في الطبق الثقافة 35 ملم. فإنه يمكن تكييفه لظروف المقايسة مختلفة بما في ذلك الثقافة خلية مختلفة الأحجام، ومصفوفات مختلفة أو قوة الالتصاق، وتشيمواتراكتانتس المختلفة. يمكن هذا التحليل بمثابة منصة في المختبر للفحص الأولى في عملية اكتشاف المخدرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تصف مقايسة غزو عمودي مقلوب بسيطة وملائمة لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا التي نادرة و/أو تعتمد على بهم المكروية. في هذه المقايسة غزو 3D، الخلايا تظل في بهم المكروية الأصلي ومشمولة جل الكولاجين التي تحتوي على تشيمواتراكتانت. الخلايا ثم ترحيل وغزو في الكولاجين. ف?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل “المعاهد الوطنية للصحة” (نيمهد-G12MD007581) من خلال ركمي-المركز “الصحة البيئية” في جامعة ولاية جاكسون والإدارة الأمريكية للدفاع، فكرة جائزة 11-1-0205.
Materials
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
Riferimenti
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
- Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
- Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
- Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198 (2008).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
- Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
- McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
- Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).
