Alla ricerca di Driver delle vie di acquisito resistenza alla terapia mirata: generazione farmacoresistenti Subclone e sensibilità ripristino di Gene Knock-down

Summary

Si tratta di un protocollo di tempo e costi efficaci in vitro indagare i meccanismi della resistenza acquisita agli agenti terapeutici mirati, che è un bisogno medico altamente insoddisfatto in gestione del cancro.

Abstract

Negli ultimi due decenni hanno visto uno spostamento da farmaci citotossici a terapia mirata in oncologia medica. Anche se gli agenti terapeutici mirati hanno dimostrato efficacia clinica più impressionante e ridotto al minimo gli effetti negativi rispetto ai trattamenti tradizionali, farmacoresistenza è diventata la principale limitazione alla loro benefici. Diversi modelli preclinici/in vitro/in vivo di resistenza acquisita ad agenti mirati nella pratica clinica sono stati sviluppati utilizzando principalmente due strategie: manipolazione i) genetica per la modellazione di genotipi di resistenza acquisita e ii) in vitro / in vivo selezione dei modelli resistenti. Nel presente lavoro, proponiamo un quadro unificante, per indagare i meccanismi responsabili della resistenza acquisita agli agenti terapeutici mirati, a partire dalla generazione di subcloni cellulari resistenti alla droga alla descrizione del le procedure utilizzate per ripristinare la sensibilità all'inibitore di silenziamento. Questo approccio semplice di tempo e costi efficaci è ampiamente applicabile e può essere facilmente estesa per studiare i meccanismi di resistenza ad altri farmaci terapeutici mirati in istotipi differenti del tumore.

Introduction

In seguito le scoperte cruciali nella biologia molecolare e cellulare, un numero di nuove molecole antitumorali sintetizzati è stato sviluppato per mirare selettivamente oncogeniche vie di segnalazione in una vasta gamma di tipi di tumore. In particolare, composti di due categorie di agenti terapeutici mirati con proprietà uniche in oncologia, vale a dire sintetici chimici e anticorpi monoclonali ricombinanti, sono noti ad aver raggiunto successi clinici e cura del cancro drammaticamente alterato in ultimi decenni^1,2,3.

Tuttavia, nonostante la loro....

Protocol

Nota: Questo protocollo è stato regolato in modo specifico per l'analisi dei meccanismi di resistenza acquisita al trastuzumab di linee cellulari di cancro gastrico HER-positivi. Tutti gli strumenti di laboratorio necessari sono riportati nella Tabella materiali.

1. generazione di subcloni resistente di terapia mirate

Nota: Questo è il più critico e difficile da standardizzare passo nel protocollo, dovuto al fatto che diverse linee cellulari possono presentare diverse sensibilità all'inibitore terapeutico mirato indipendentemente dalla loro concentrazione di droga o istotipo del tumore utilizzato.<....

Results

Figura 1 delinea il quadro delle procedure sperimentali. Tre cancro gastrico-linee cellulari che esprimono un elevato livello di HER2 e sensibile al trastuzumab (IC₅₀ < livello del plasma di picco del grafico di sinistra di droga, Figura 2A,) sono state coltivate in terreno di coltura contenente l'agente terapeutico mirato. Una dose 10 volte inferiore la concentrazione plasmatica di picco di trastuzumab (10 µ g/mL) .......

Discussion

Mentre personalizzate e mirate terapie hanno suscitato entusiasmo crescente, queste cosiddette terapie 'intelligente' affrontano il grande ostacolo stesso come farmaci chemioterapici tradizionali, vale a dire, l'acquisizione rapida e imprevedibile di farmaco resistenza. Per migliorare i risultati della terapia mirata, farmaco-resistenza problemi devono essere risolti attraverso una migliore comprensione dei meccanismi che li provocano. Qui, abbiamo presentato una metodologia ampiamente accessibili in vitro <.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Il reagente Trizol	Invitrogen	15596026	Il reagente TRIzol è un reagente per isolare RNA totale di alta qualità o isolare contemporaneamente RNA, DNA e proteine da una varietà di campioni biologici
KIT DI SINTESI DEL CDNA ISCRIPT	Bio-Rad	1708891	Il kit di sintesi del cDNA iScript è un kit di sintesi del cDNA del primo filamento sensibile e facile da usare per l'analisi dell'espressione genica utilizzando la qPCR in tempo reale.
Saggio di espressione genica TaqMan	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems I saggi di espressione genica TaqMan sono costituiti da una coppia di primer PCR non marcati e da una sonda TaqMan con un'etichetta colorante FAM o VIC di Applied Biosystems all'estremità 5' e un legante di solco minore (MGB) e un quencher non fluorescente (NFQ) all'estremità 3'.
Reagente per l'estrazione di proteine di mammifero M-PER	Thermo Scientific	78501	Il reagente per l'estrazione di proteine di mammifero M-PER è progettato per fornire un'estrazione di proteine solubili totali altamente efficiente da cellule di mammifero in coltura.
Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi Halt (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Il cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi Halt (100X) offre la comodità di un'unica soluzione con protezione completa del campione proteico per lisati cellulari e tissutali.
Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA	Thermo Scientific	23225	Il kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA di Thermo Scientific è un set di test a due componenti, ad alta precisione e compatibile con i detergenti, per misurare la concentrazione totale di proteine (A562 nm) rispetto a uno standard proteico.
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	Utilizzare 4x Laemmli Sample Buffer per la preparazione dei campioni per SDS PAGE. Per la riduzione dei campioni, aggiungere un agente riducente come il 2-mercaptoetanolo al tampone prima di miscelarlo con il campione.
4– Gel proteici prefabbricati Mini-PROTEAN TGX al 20%	Bio-Rad	456-1094	I gel TGX (Tris-Glycine eXtended) a lunga durata hanno una nuova formulazione e possono essere utilizzati sia per le separazioni standard di proteine denaturanti che per l'elettroforesi nativa.
Standard di blotting Precision Plus Protein WesternC	Bio-Rad	1610376	standard Precision Plus Protein Prestained sono disponibili nei formati Dual Color, All Blue, Kaleidoscope e Dual Xtra. Tutti e quattro hanno gli stessi modelli di migrazione del gel, con 3 bande di riferimento ad alta intensità (25, 50 e 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS è un tampone di corsa premiscelato per la separazione di campioni proteici mediante SDS-PAGE.
Pacchetti di trasferimento Trans-Blot Turbo Mini PVDF Bio-Rad		1704156	Pacchetti di trasferimento Trans-Blot Turbo Mini PVDF per un trasferimento rapido ed efficiente di proteine da mini gel utilizzando il sistema di trasferimento Trans-Blot Turbo. Ogni confezione di trasferimento sigillata sottovuoto e pronta all'uso contiene due pile di serbatoi di ioni saturi di tampone e una membrana in PVDF prebagnata.
Coniugato Precision Protein StrepTactin-HRP	Bio-Rad	1610381	Coniugato StrepTactin-Perossidasi di Rafano (HRP) per la rilevazione chemiluminescente o colorimetrica degli standard proteici non colorati Precision Plus Protein o degli standard proteici Precision Plus Protein WesternC su western blot.
Soluzione Immun-Star WesternC	Bio-Rad	5572	La soluzione Immun-Star WesternC, un metodo di rilevamento delle proteine, rileva le quantità di proteine a metà femtogramma.
Il siRNA a controllo negativo universale		12935300	controllo negativo non ha somiglianze significative con sequenze geniche di topo, ratto o uomo. Il controllo è stato testato anche in screening cellulari e ha dimostrato di non avere alcun effetto significativo sulla proliferazione, la vitalità o la morfologia cellulare.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium è un terreno minimo essenziale (MEM) migliorato che consente una riduzione dell'integrazione di siero fetale bovino di almeno il 50% senza alcun cambiamento nel tasso di crescita o nella morfologia.
Selezione del silenziatore Pre-progettato e L'interferenza			dell'RNA (RNAi) 4390824 siRNA convalidata è il modo migliore per abbattere efficacemente l'espressione genica e studiare la funzione delle proteine in un'ampia gamma di tipi di cellule.
Reagente di trasfezione Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778075	Reagente di trasfezione Lipofectamine RNAiMAX offre una soluzione avanzata ed efficiente per la somministrazione di siRNA. Nessun altro reagente di trasfezione specifico per siRNA fornisce una somministrazione di siRNA così facile ed efficiente in un'ampia varietà di linee cellulari, inclusi tipi di cellule comuni, cellule staminali e cellule primarie, nonché tipi di cellule tradizionalmente difficili da trasfettare.
Topo anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	concentrazione di lavoro: 1:400 in soluzione di latte al 5%
capra anti-topo IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	concentrazione di lavoro: 1:10000 in soluzione di latte al 5%
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	questo è un inibitore delle proteasi serina e dell'acetilcolinesterasi
Termociclatore per RT-PCR	MJ Research MJ Research	PTC-200 Termociclatore	consente l'omogeneità della temperatura e una velocità di rampa fino a 3 gradi C/sec. Il protocollo può essere eseguito anche con altri termociclatori
Strumento RT-PCR in tempo reale	RT-PCR Applied Biosystems 7500		Si tratta di una piattaforma a cinque colori che utilizza reagenti di reazione a catena della polimerasi (PCR) basati sulla fluorescenza per fornire una quantificazione relativa utilizzando il tipo di saggio comparativo CT. Il protocollo può essere eseguito anche con altri termociclatori
Spettrofotometri per microvolumi	Thermo Scientific	Nanodrop	Fornisce una misura accurata e veloce dei nucleidi acidi utilizzando un piccolo volume di campione
Sistema di blotting	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo	Esegue un trasferimento semy-dry in pochi minuti
Sistema di acquisizione immagini e documentazione su gel Immagine	Bio-Rad	Chemidoc è	facile da usare per il rilevamento chemiluminescente