פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של קלטת קטן, מוכן לשימוש, שניתן להחיל לצורך זיהוי חזותי של מספר חומצות גרעין בבדיקה אחת, קלה לתפעול. בגישה זו, מערך נימי שימש לצורך זיהוי מולטיפלקס ויעיל מאוד של GMO מטרות.
מטרות מרובות, זמן קצר, ומתודולוגיות משאבים-סבירים עבור הגילוי של מספר חומצות גרעין יחיד, קלה לתפעול הבדיקה נדרשים בדחיפות אבחון מחלת, ניטור מיקרוביאלי, זיהוי אורגניזם מהונדס גנטית (GMO), ו בדיקת מז פ. בעבר תארנו פלטפורמת שנקרא שלווה (Capillary Aמבוססי rray Lבתיווך oop איזותרמי הגברה לצורך זיהוי חזותי של ultiplex מ’של חומצות גרעין). במסמך זה, אנו מתארים משופרת ייצור ותהליכים ביצועים עבור הפלטפורמה. כאן, אנו מיישמים קלטת קטנה, מוכן לשימוש נאספו על ידי מערך נימי לזיהוי חזותי מולטיפלקס של חומצות גרעין. המערך נימי הוא התייחס מראש לתוך תבנית הידרופוביות, הידרופילית לפני תיקון בתיווך לופ הגברה איזותרמי (מנורה) פריימר קבוצות נימים. לאחר הרכבה של מתאם טעינה, תערובת התגובה המנורה טעון, מבודד לתוך כל נים, עקב כוח נימי מאת pipetting צעד אחד. התגובות המנורה מתבצעים במקביל הנימים. התוצאות נקראים חזותית על ידי תאורה עם פנס UV ידניים. באמצעות פלטפורמה זו, נדגים ניטור של 8 לעתים קרובות להופיע ורכיבים של גנים בדגימות GMO ירידה לפרטים גבוהה ורגישות. לסיכום, פלטפורמת המתוארים במסמך זה נועד להקל על הזיהוי של מספר חומצות גרעין. אנו מאמינים שיהיה החלים נרחב בתחומים בהם דרושה ניתוח חומצת גרעין תפוקה גבוהה.
מערכות בעלות נמוכה, מהירה, קלה לשימוש עבור גילוי בו זמנית של מספר חומצות גרעין נחוצים בדחיפות במגוון רחב של תחומים, כגון אבחון קליני1,2,3, זיהוי GMO4, 5,6, חיידקים ניטור7,8,9, בדיקת מז פ10,11, במיוחד בשלב של טיפול בדיקות (POCTs), שבו משאבים הם בדרך כלל מוגבלת12,13,14.
תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), כולל שיטות נגזרות שלו בזמן אמת PCR ו- PCR מולטיפלקס, היא הטכניקה שימושית נרחב ביותר לגילוי בתחומים אלה. עם זאת, שיטות אלה בדרך כלל לזהות רק מטרה אחת מבחן אחד15 והן דורשות חשמל וציוד מקצועי ומתוחכם.
טכנולוגיה מבטיחה אחרת לגילוי חומצות גרעין הוא בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (מנורה), אשר תוארה לראשונה בשנת 200016. המנורה היא יעילות גבוהה שיטת זיהוי ה-DNA. באופן תיאורטי, זה להגביר את מעותק 1 ל 109 עותקים של amplicons בתוך שעה אחת, כל תרגיל בטמפרטורה קבועה, (דהיינו, בין 60-65 מעלות צלזיוס). הגברה מוצלח לייצר כמות גדולה של רב-תכליתי לוואי לא מסיסים, לגרום לשינוי במצב עכירות17, אשר יכול להיות שנצפו ישירות בעין בלתי מזוינת. שינוי צבע יכול גם להיות שנצפו על ידי התוספת של יונים מתכתיים או צבעי פלורסנט כגון Calcein18, חומצת גרעין לצבוע19הידרוקסיל naphthol כחול20. בגלל היתרונות של רגישות גבוהה ונוחות של המבצע, המנורה מוחל נרחב בזיהוי חומצת גרעין.
כיום, קיימות אסטרטגיות בעיקר שני מבחני המנורה מולטיפלקס. אחת היא לבצע מבחני המנורה מרובים על-ידי המנורה מרובים פריימר מגדיר את שפופרת אחת21,22,23. עם זאת, הריבוי ואת היעילות הגברה מוגבלת על ידי הפרעה פנימית ועל תחרות בין קבוצות שונות פריימר. יתר על כן, זה יכול להיות קשה לזהות מוצרים שונים המנורה אותה התגובה. אסטרטגיה נוספת מבוססת על בידוד פיזי. ערכות פריימר שונים היו מבודדים לתוך תאים בודדים מיניאטורי, וכל מספר תגובות המנורה ואז יבוצעו בו זמנית24,25. גישות אלה, אשר בדרך כלל מבוססים על שבבי microfluidic, מספקים פתרון אפשרי לתגובות המנורה תפוקה גבוהה. אולם, לייצור השבבים ואת הציפוי קדם מולטיפלקס של ערכות פריימר הוא מסובך, אשר עשויים להגדיל את עלויות ולהקטין הפארמצבטית.
לאחרונה, מחקרים אחדים תיארו המנורה ביצוע, בתגובות נימים לעקוף את הזיוף מסובך של שבבי microfluidic, השיגו בעלות נמוכה זיהוי26,27. עם זאת, לגבי ניתוח תפוקה גבוהה, נימים אלה דומים מיניאטורי גירסאות של רצועת המבחנות כי הדגימות ואת התגובה ריאגנטים (כולל ערכות שונות פריימר) חייב להיות בנפרד מוכן להישלח שונים תגובת יחידות בתוך נימים. כדי להשיג במקביל וניתוח מולטיפלקס, ציוד נוסף, לדוגמה משאבת מזרק רב-ערוצי, נדרש לטעינה מקבילים של דוגמאות או נוגדנים.
כדי להתגבר על המגבלות הקשורות השיטות לגילוי מולטיפלקס של חומצות גרעין, פיתחנו פלטפורמה ולמחקר המשלב טכנולוגיה המנורה חזותית עם מערך נימי. פלטפורמה זו היא מטרות מרובות, קומפקטית בגודל, עלות נמוכה, וקל לתפעול28. במסמך זה, אנו מתארים את הפרטים של כיצד לפברק את מערך נימי ולבצע את התגובות המנורה במערך. הפרוטוקול המתואר כאן יש כבר סטנדרטית באמצעות זיהוי אורגניזם מהונדס גנטית (GMO) כמודל. חשוב לציין, פרוטוקול זה יכול לשמש גם בזיהוי תפוקה גבוהה של מטרות חומצות גרעין אחרות.
פלטפורמת רגוע המודגמות כאן, אשר משלבת את הטכנולוגיה המנורה עם מערך נימי, מאפשרת זיהוי מטרות מרובות הקשורות GMO גן יחיד, מאוד יעיל וקל לתפעול מבחן בו זמנית.
כדי לבצע בהצלחה את התגובות המנורה מולטיפלקס בקלטת, שלוש נקודות קריטיות צריך להיות לב. ראשית, להשגת באותו גובה בחלק העליון…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה היה מומן בחלקו על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין מענקים (31370813, 3147670, 31670831, 31600672,), הטרנסגניים צמח מיוחד הקרן (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), תוכנית עבור כשרונות חדשים של מצוינות המאה ב האוניברסיטה הלאומית למחקר מפתח, פרוייקט פיתוח של סין (2016YFA0500601) ו סין-דוקטורט למדע (2016 ז 591667).
UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |