Этот протокол описывает изготовление малых, готовых к использованию кассеты, которые могут быть применены для визуального обнаружения нескольких нуклеиновых кислот в единый, тест, который прост в эксплуатации. В этом подходе капиллярные массив был использован для мультиплекс и высокоэффективного обнаружения целей ГИО.
Срочно необходимы нескольких целей, короткое время и ресурс доступные методологии для обнаружения нескольких нуклеиновых кислот в единый, простой в эксплуатации тест в диагностике заболеваний, микробной мониторинг, обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО), и судебно-медицинской экспертизы. Ранее мы описали платформы, называется спокойствия (Capillary Aна основе rray LООП опосредованной изотермической амплификация Multiplex визуального обнаружения нуклеиновых кислот). Здесь мы описываем, совершенствование производства и производительности процессов для этой платформы. Здесь мы применяем небольшой, готовых к использованию Кассета собрана капиллярной массив для мультиплекс визуального обнаружения нуклеиновых кислот. Капиллярные массив предварительно обработанные в шаблон гидрофобных и гидрофильных перед закреплением цикла опосредованной изотермической амплификация (лампа) грунт наборы в капиллярах. После сборки адаптера для загрузки лампа реакционную смесь загружается и изолированных в каждой капилляров, благодаря капиллярные силы один шаг дозирования. ЛАМПА реакции выполняются параллельно в капиллярах. Результаты являются визуально зачитал освещения с портативных Фонарик УФ. С помощью этой платформы, мы демонстрируем, мониторинг 8, часто появляются элементы и гены в образцах ГИО с высокой специфичности и чувствительности. Таким образом платформа, описываемые предназначен для облегчения обнаружения нескольких нуклеиновых кислот. Мы считаем, что это будет широко применяться в областях, где высок объём нуклеинокислотный анализ не требуется.
В широком диапазоне областей, таких как диагностика1,2,3, ГИО обнаружения4, срочно необходимы недорогой, быстрый и простой в использовании системы для одновременного обнаружения нескольких нуклеиновых кислот 5,6, микробных контроля7,8,9, криминалистического анализа10,11и особенно точки обслуживания тестов (POCTs), где ресурсы Это обычно ограничен12,,1314.
Полимеразной цепной реакции (ПЦР), включая его производные методы ПЦР в реальном времени и мультиплексной ПЦР, является наиболее широко применяемым методом для обнаружения в этих областях. Однако эти методы обычно только обнаруживать цели в один в один тест15 , и они требуют электричества и современное профессиональное оборудование.
Другой многообещающей технологии для обнаружения нуклеиновые кислоты-петля опосредованной изотермической амплификация (лампа), который был впервые описан в 2000 году16. ЛАМПА является высокая эффективность метода обнаружения ДНК. Теоретически это может усилить от 1 экземпляра 109 копий ампликонами, в течение одного часа, все выполняется при постоянной температуре, (то есть, между 60-65 ° C). Успешное усиление будет производить большое количество нерастворимых побочным пирофосфат и приводит к изменению мутности17, который можно непосредственно наблюдать невооруженным глазом. Изменение цвета может также наблюдаться добавлением металлических ионов или флуоресцентными красителями Флуорексон18, нуклеиновые кислоты краситель19и гидроксила Нафтол синий20. Из-за преимущества высокой чувствительностью и удобство эксплуатации лампа широко применяется в обнаружения нуклеиновой кислоты.
В настоящее время главным образом две стратегии для мультиплекс лампа анализов. Один — выполнить несколько анализов лампа, имея несколько лампа грунтовка задает в одной из труб21,,2223. Однако множественности и усиления эффективности будет ограничиваться внутренней вмешательства и конкуренция между различными грунтовка наборы. Кроме того это может быть трудно определить различные продукты лампа в такую же реакцию. Другая стратегия основана на физической изоляции. Наборы различных грунтовка были изолированы в отдельных миниатюрных отсеков, и затем одновременно выполняются несколько реакций лампа24,25. Эти подходы, которые как правило основаны на microfluidic фишки, обеспечивают потенциальное решение для высокой пропускной способности лампа реакций. Однако, производство чипов и мультиплексной Предварительное покрытие грунт наборов сложных, которые могут увеличить издержки и уменьшить воспроизводимость.
Недавно несколько исследований описал исполняющая лампа реакции в капиллярах обойти сложные изготовление microfluidic чипов и достигли лоу кост обнаружения26,27. Однако относительно высок объём анализа, эти капилляры похожи на миниатюрные версии ПЦР газа трубок, потому что образцы и реагенты реакции (включая наборы различных грунтовка) должны быть индивидуально подготовлен и доставлены в различные реакция подразделения капилляров. Для достижения анализа параллельных и мультиплекс, дополнительное оборудование, например многоканальный шприцевый насос, является обязательным для параллельной загрузки образцов или реагенты.
Чтобы преодолеть ограничения, связанные с текущими методами для мультиплекс обнаружения нуклеиновых кислот, мы разработали миниатюрных платформу, которая сочетает в себе технологию визуального лампа с массивом капилляров. Эта платформа нескольких целей, компактный размер, низкая стоимость и легко работать28. Здесь мы описываем подробности о том, как изготовить капиллярного массив и выполнять лампа реакции в массиве. Протокол, описанные здесь был унифицирован с использованием генетически измененных организмов (ГИО) обнаружения как модель. Важно отметить, что этот протокол может использоваться также в высокой пропускной способности обнаружения других целей нуклеиновых кислот.
СПОКОЙНЫМ платформы продемонстрировали здесь, который сочетает в себе технологии лампы с массивом капилляров, позволяет одновременное обнаружение нескольких генов, связанных с ГИО целей в единый, высоко эффективный и простой в эксплуатации тест.
Чтобы успешно выполнит…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование финансировалось частично национальных естественных наук из Китая гранты фонда (31370813, 3147670, 31670831 и 31600672,), Национальный трансгенных растений Специальный фонд (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), программа для нового века отличные таланты в Университет, национальных исследований и проект развития Китая (2016YFA0500601) и Китай Докторантура научный фонд (2016 М 591667).
UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |