Denne protokol beskriver fabrikation af en lille, klar-til-brug kassette, der kan anvendes til visuel genkendelse af flere nukleinsyrer i en enkelt, test, der er nem at betjene. I denne tilgang, blev en kapillær array brugt til multiplex og yderst effektiv påvisning af GMO mål.
Multi-Target, kort tid og ressource-overkommelige metoder til påvisning af flere nukleinsyrer i en enkelt, nem at betjene test er påtrængende i klovesygediagnosticering, mikrobiel overvågning, påvisning af genetisk modificeret organisme (GMO), og retskemisk analyse. Vi har tidligere beskrevet den platform kaldet ro (Capillary Array-baserede Loop-medieret isotermisk forstærkning for Multiplex visuel genkendelse af nukleinsyrer). Heri, beskriver vi forbedret fabrikation og performance processer for denne platform. Her anvender vi en lille, klar-til-brug kassette samlet af kapillar array for multiplex visuel genkendelse af nukleinsyrer. Den kapillære array er forbehandlet i en hydrofobe og hydrofile mønster før fastsættelse loop-medieret isotermisk forstærkning (lampe) primer sæt i kapillærer. Efter montering af lastning adapter, er lampe reaktionsblandingen indlæst og isoleret i hver kapillær, på grund af kapillær kraft af en enkelt pipettering trin. LAMPE reaktioner udføres parallelt i kapillærerne. Resultaterne er visuelt læse af belysning med en håndholdt UV lommelygte. Du bruger denne platform, vise vi overvågning af 8 ofte optræder elementer og gener i GMO prøver med høj specificitet og sensitivitet. I Resumé, er platform beskrevet heri beregnet til at lette afsløringen af flere nukleinsyrer. Vi mener, at det vil være almindeligt gældende i felter hvor høj overførselshastighed nukleinsyre analyse er påkrævet.
Billig, hurtig og nem at bruge systemer til simultan påvisning af flere nukleinsyrer er behov for i en lang række områder, såsom klinisk diagnostik1,2,3, GMO påvisning4, 5,6, mikrobiel overvågning7,8,9, retskemisk analyse10,11, og især punkt af pleje tests (POCTs), hvor ressourcer er som regel begrænset12,13,14.
Polymerase kædereaktion (PCR), herunder dens afledte metoder real-time PCR og multiplex PCR, er den mest almindeligt anvendte teknik til påvisning i disse felter. Men disse metoder typisk kun finde ét mål i én test15 og de kræver elektricitet og avancerede professionelle udstyr.
En anden lovende teknologi til påvisning af nukleinsyrer er Loop-medieret isotermisk forstærkning (lampe), som blev første gang beskrevet i 200016. LAMPE er en høj effektivitet DNA påvisningsmetode. Teoretisk set kan det forstærke fra 1 kopi til 109 kopier af amplikoner inden for en time, alle udført ved en konstant temperatur, (dvs.mellem 60-65 ° C). Vellykket forstærkning vil producere en stor mængde af uopløselige biprodukt pyrofosfat og forårsage en ændring i turbiditet17, der direkte kunne ses med det blotte øje. En farveændring kan også observeres ved tilsætning af metalioner eller fluorescerende farvestoffer såsom Calcein18, nukleinsyre farvestof19og hydroxyl naphthol blå20. På grund af fordelene af høj følsomhed og bekvemmelighed i drift, er LAMPEN anvendes bredt i nukleinsyre genkendelse.
I øjeblikket, er der især to strategier for multiplex lampe assays. Et er at udføre flere lampe assays ved at have flere lampe primer sætter i en tube21,22,23. Dog vil mangfoldigheden og forstærkning effektivitet være begrænset af den iboende indblanding og konkurrence mellem forskellige primer sæt. Derudover kan det være vanskeligt at identificere forskellige lampe produkter i den samme reaktion. En anden strategi er baseret på fysisk isolering. Forskellige primer sæt blev isoleret i enkelte miniaturized rum, og flere lampe reaktioner er derefter udføres samtidig24,25. Disse tilgange, som er generelt baseret på mikrofluid chips, give en mulig løsning for høj overførselshastighed lampe reaktioner. Fremstilling af chips og multiplex før overfladebehandling af primer sæt er imidlertid komplicerede, som kan øge omkostningerne og mindske reproducerbarhed.
For nylig, et par undersøgelser har beskrevet ydende lampe reaktioner i kapillærer hen til omgå den komplicerede fabrikation af mikrofluid chips og har opnået lavpris-påvisning26,27. Men med hensyn til høj overførselshastighed analyse, disse kapillærer er ligner miniatureudgaver af PCR strip rør, fordi de prøver og reaktion reagenser (herunder forskellige primer sæt) skal individuelt forberedes og leveres til forskellige reaktion enheder inden for kapillærer. For at opnå parallelle og multiplex analyse, er ekstra udstyr, for eksempel en multikanals sprøjten pumpe, nødvendig for parallelle lastning af prøver eller reagenser.
For at overvinde de begrænsninger i forbindelse med de nuværende metoder til multiplex påvisning af nukleinsyrer, har vi udviklet en miniaturized platform, der kombinerer visuelle lampe teknologi med en kapillær array. Denne platform er multi-Target, kompakt i størrelse, lave omkostninger og let at betjene28. Heri, beskrive vi detaljerne i hvordan man kan fabrikere den kapillære array og udføre lampe reaktioner i matrixen. Protokollen beskrevet her er blevet standardiseret ved hjælp af genetisk modificerede organismer (GMO’er) opdagelse som model. Vigtigst, kan denne protokol også bruges i høj overførselshastighed påvisning af andre nukleinsyre mål.
Den ROLIGE platform vist her, som kombinerer den lampe teknologi med en kapillær array, muliggør samtidige påvisning af flere GMO-relaterede gen mål i en enkelt, meget effektiv og nem at betjene test.
Med succes klarer de multiplex lampe reaktioner i kassetten, skal tre kritiske punkter at blive bemærket. For det første, at opnå den samme højde for den øverste side af kapillærer og de hydrofile og hydrofobe mønster af matrixen kapillær er kritiske for samtidig ilægning reagenser i…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse var delvis finansieret af National Natural Science Foundation i Kina tilskud (31370813, 3147670, 31670831 og 31600672,), den nationale transgene planter særlig fond (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), programmet for nye århundrede fremragende talenter i Universitet, nationale centrale forskning og udviklingsprojekt af Kina (2016YFA0500601) og Kina postdoc Science Foundation (2016M 591667).
UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |