Visuel genkendelse af flere nukleinsyrer i en kapillær Array
Summary
Denne protokol beskriver fabrikation af en lille, klar-til-brug kassette, der kan anvendes til visuel genkendelse af flere nukleinsyrer i en enkelt, test, der er nem at betjene. I denne tilgang, blev en kapillær array brugt til multiplex og yderst effektiv påvisning af GMO mål.
Abstract
Multi-Target, kort tid og ressource-overkommelige metoder til påvisning af flere nukleinsyrer i en enkelt, nem at betjene test er påtrængende i klovesygediagnosticering, mikrobiel overvågning, påvisning af genetisk modificeret organisme (GMO), og retskemisk analyse. Vi har tidligere beskrevet den platform kaldet ro (Capillary Array-baserede Loop-medieret isotermisk forstærkning for Multiplex visuel genkendelse af nukleinsyrer). Heri, beskriver vi forbedret fabrikation og performance processer for denne platform. Her anvender vi en lille, klar-til-brug kassette samlet af kapillar array for multiplex visuel genkendelse af nukleinsyrer. Den kapillære array er forbehandlet i en hydrofobe og hydrofile mønster før fastsættelse loop-medieret isotermisk forstærkning (lampe) primer sæt i kapillærer. Efter montering af lastning adapter, er lampe reaktionsblandingen indlæst og isoleret i hver kapillær, på grund af kapillær kraft af en enkelt pipettering trin. LAMPE reaktioner udføres parallelt i kapillærerne. Resultaterne er visuelt læse af belysning med en håndholdt UV lommelygte. Du bruger denne platform, vise vi overvågning af 8 ofte optræder elementer og gener i GMO prøver med høj specificitet og sensitivitet. I Resumé, er platform beskrevet heri beregnet til at lette afsløringen af flere nukleinsyrer. Vi mener, at det vil være almindeligt gældende i felter hvor høj overførselshastighed nukleinsyre analyse er påkrævet.
Introduction
Billig, hurtig og nem at bruge systemer til simultan påvisning af flere nukleinsyrer er behov for i en lang række områder, såsom klinisk diagnostik1,2,3, GMO påvisning4, 5,6, mikrobiel overvågning7,8,9, retskemisk analyse10,11, og især punkt af pleje tests (POCTs), hvor ressourcer er som regel begrænset12,13,14.
Polymerase kædereaktion (PCR), herunder dens afledte metoder real-time PCR og multiplex PCR, er den mest almindeligt anvendte teknik til påvisning i disse felter. Men disse metoder typisk kun finde ét mål i én test15 og de kræver elektricitet og avancerede professionelle udstyr.
En anden lovende teknologi til påvisning af nukleinsyrer er Loop-medieret isotermisk forstærkning (lampe), som blev første gang beskrevet i 200016. LAMPE er en høj effektivitet DNA påvisningsmetode. Teoretisk set kan det forstærke fra 1 kopi til 109 kopier af amplikoner inden for en time, alle udført ved en konstant temperatur, (dvs.mellem 60-65 ° C). Vellykket forstærkning vil producere en stor mængde af uopløselige biprodukt pyrofosfat og forårsage en ændring i turbiditet17, der direkte kunne ses med det blotte øje. En farveændring kan også observeres ved tilsætning af metalioner eller fluorescerende farvestoffer såsom Calcein18, nukleinsyre farvestof19og hydroxyl naphthol blå20. På grund af fordelene af høj følsomhed og bekvemmelighed i drift, er LAMPEN anvendes bredt i nukleinsyre genkendelse.
I øjeblikket, er der især to strategier for multiplex lampe assays. Et er at udføre flere lampe assays ved at have flere lampe primer sætter i en tube21,22,23. Dog vil mangfoldigheden og forstærkning effektivitet være begrænset af den iboende indblanding og konkurrence mellem forskellige primer sæt. Derudover kan det være vanskeligt at identificere forskellige lampe produkter i den samme reaktion. En anden strategi er baseret på fysisk isolering. Forskellige primer sæt blev isoleret i enkelte miniaturized rum, og flere lampe reaktioner er derefter udføres samtidig24,25. Disse tilgange, som er generelt baseret på mikrofluid chips, give en mulig løsning for høj overførselshastighed lampe reaktioner. Fremstilling af chips og multiplex før overfladebehandling af primer sæt er imidlertid komplicerede, som kan øge omkostningerne og mindske reproducerbarhed.
For nylig, et par undersøgelser har beskrevet ydende lampe reaktioner i kapillærer hen til omgå den komplicerede fabrikation af mikrofluid chips og har opnået lavpris-påvisning26,27. Men med hensyn til høj overførselshastighed analyse, disse kapillærer er ligner miniatureudgaver af PCR strip rør, fordi de prøver og reaktion reagenser (herunder forskellige primer sæt) skal individuelt forberedes og leveres til forskellige reaktion enheder inden for kapillærer. For at opnå parallelle og multiplex analyse, er ekstra udstyr, for eksempel en multikanals sprøjten pumpe, nødvendig for parallelle lastning af prøver eller reagenser.
For at overvinde de begrænsninger i forbindelse med de nuværende metoder til multiplex påvisning af nukleinsyrer, har vi udviklet en miniaturized platform, der kombinerer visuelle lampe teknologi med en kapillær array. Denne platform er multi-Target, kompakt i størrelse, lave omkostninger og let at betjene28. Heri, beskrive vi detaljerne i hvordan man kan fabrikere den kapillære array og udføre lampe reaktioner i matrixen. Protokollen beskrevet her er blevet standardiseret ved hjælp af genetisk modificerede organismer (GMO’er) opdagelse som model. Vigtigst, kan denne protokol også bruges i høj overførselshastighed påvisning af andre nukleinsyre mål.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ROLIGE platform vist her, som kombinerer den lampe teknologi med en kapillær array, muliggør samtidige påvisning af flere GMO-relaterede gen mål i en enkelt, meget effektiv og nem at betjene test.
Med succes klarer de multiplex lampe reaktioner i kassetten, skal tre kritiske punkter at blive bemærket. For det første, at opnå den samme højde for den øverste side af kapillærer og de hydrofile og hydrofobe mønster af matrixen kapillær er kritiske for samtidig ilægning reagenser i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse var delvis finansieret af National Natural Science Foundation i Kina tilskud (31370813, 3147670, 31670831 og 31600672,), den nationale transgene planter særlig fond (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), programmet for nye århundrede fremragende talenter i Universitet, nationale centrale forskning og udviklingsprojekt af Kina (2016YFA0500601) og Kina postdoc Science Foundation (2016M 591667).
Materials
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
Riferimenti
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).
- Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).
- Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).
- Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522 (2), 123-132 (2013).
- Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how?. J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).
- Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).
- Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).
- Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).
- Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).
- Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).
- Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).
- Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).
- Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).
- Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
- Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).
- Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).
- Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).
- Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).
- Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).
- Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).
- Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).
- Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).
- Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. , (1998).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).
