Studere svulst microenvironment kan identifisere prognostiske eller prediktiv biomarkers av kliniske svar immunterapi. Presenteres her, er en innovativ metode basert på i situ fluorescens multispectral imaging for å analysere og telle automatisk ulike subpopulasjoner av CD8+ T celler. Denne reproduserbare og pålitelig teknikken er egnet for store kohort analyser.
Immunceller er viktige komponenter i svulst microenvironment og påvirke tumor vekst og utviklingen i alle stadier av kreft. Spesielt er det nå godt etablert at det immun infiltrere i menneskelig svulster kan sammenligne med prognose og respons på behandling. Analyse av den immun infiltrere i svulst microenvironment har blitt en stor utfordring for klassifisering av pasienter og respons på behandling.
Co uttrykk for hemmende reseptorer som programmet celle død Protein 1 (PD1, også kjent som CD279), cytotoksisk T lymfocytt forbundet Protein 4 (CTLA-4), T-celle immunglobulin og Mucin som inneholder Protein-3 (Tim-3, også kjent som CD366) og lymfocytter Aktivisering genet 3 (Lag-3, også kjent som CD223), er et kjennetegn på T celle utmattelse. Vi utviklet en multiparametric i situ immunofluorescence flekker og kvantifisere på cellenivå co uttrykket av disse hemmende reseptorer. På en retrospektiv rekke frossent av nyre celle kreftsvulster (RCC), bruke en fluorescens multispectral imaging teknologi kombinert med en analyseprogramvare, ble det funnet co uttrykket av PD-1 og Tim-3 på svulst infiltrere CD8+ T celler er korrelert med en dårlig prognose i RCC. Vi vet, dette representerer den første studien viser at dette automatisert multiplex i situ teknologi kan ha noen klinisk relevans.
I de siste årene, har immunterapi framstått som en meget lovende behandling for mange typer kreft, inkludert RCC. Spesielt immunterapi basert på hemming av hemmende sjekkpunkter som PD-1 og CTLA-4 har blitt rapportert å være klinisk effektiv1,2,3,4,5, 6. monoklonale antistoffer mot CTLA-4, PD-1 eller Program død Ligand 1 (PD-L1) er allerede godkjent i flere typer kreft og føre langvarig kliniske tiltak i mer enn 20% av pasientene7. Likevel, ikke alle pasienter er respondere, behandling er høy og disse behandlingene er giftige, fører til potensielle alvorlig autoimmun-lignende bivirkninger. Derfor er nåværende utfordringen å identifisere prediktiv indikatorer som de nye immunotherapies. Frekvensen av mutasjoner i svulsten, uttrykk for PD-L1 eller nivåer av intratumoral CD8+ T celle infiltrasjon har blitt rapportert å korrelere med klinisk respons. Denne tilknytningen er imidlertid fortsatt svak anbefaler bruk av disse kliniske biomarkers i klinisk praksis bortsett fra kameraten testen for PD-L1 før administrasjonen av Pembrolizumab i ikke-småcellet lungekreft kreft (NSCLC) pasienter8 ,9,1011,12. Det har blitt demonstrert at co uttrykk for mange hemmende reseptorer som PD-1, Tim-3, Lag-3, og CTLA-4, induserer en celle utmattelse fenotypen og motstand mot terapi13,14,15. Siden perifert blod ikke er representative for svulst microenvironment, er det stor interesse å analysere fenotypiske funksjonene i cellene i situ. PD-1 og Tim-3 co uttrykke T-celler er kjent for å være funksjonelt nedsatt celler i flere sammenhenger13,16,17. I denne studien, prognostiske virkningen av co uttrykk for to hemmende receptors PD-1 og Tim-3 på CD8+ T celler ble vurdert.
Opp til nå, studere co uttrykk for flere indikatorer på svulst infiltrere lymfocytter (TILs) er hovedsakelig utført av flyt cytometri analyse, noe som gjør det nødvendig å arbeide med fersk svulster og derfor utelukker retrospektiv analyser. Med konvensjonelle i situ flekker, eneste flekker samtidig kan utføres, og karakterisering av hvilken celle som co uttrykker markørene er ikke mulig. For eksempel er PD-L1 uttrykt ved mange celletyper av tumoral microenvironment, gjør det vanskelig å definere ved konvensjonelle immunohistochemistry analyse hvilke celler uttrykke PD-L1 er mer relevante for correlative studier. I dette arbeidet, vi utviklet en nyskapende i situ multiparametric immunofluorescence metode med datamaskin-telling for å sammenligne co uttrykket av PD-1 og Tim-3 av svulst infiltrere CD8+ T-celler med kliniske utfall i RCC. Denne teknikken har flere fordeler, inkludert muligheten til å analysere på en enkelt celle og flere markører samtidig med et multispectral kamera som kan fange begrenset intervaller > 10 nm gjennom krystall filtrerer18. Videre er fremgangsmåten automatisk som muliggjør en mellom operatører reproduserbarhet og en forkortet analyse forhold til manuelle teknikker19. I feltet kreft rapportert flere studier overbevise flere stainings av immun molekyler som PD-1, PD-L1 og CD8 Merkel celle carcinoma, lungekreft og hode og nakke kreft20,21,22, 23. de automatiserte celletall er mulig med opplæring av brukeren (phenotyping trinn). Fluorescensen måles i de ulike celle avdelinger (kjerner, cytoplasma og membran).
Her, forskjellige undergrupper av svulst-infiltrere CD8+ T celler uttrykke PD-1 og/eller Tim-3 i en stor kohort av RCC ble regnet og resultatene var korrelert med klinisk tyngdekraften score og overlevelse parametere. Det var også mulig å analysere membran fluorescens intensitet på mobilnettet oppløsningen mener fluorescens intensitet (MFI) data som i cytometri. Så vidt vi vet, er dette de første studien rapportering prognostiske resultatene bruker denne multispectral tenkelig basert teller teknikken.
Endringer og feilsøking:
Vev kvaliteten er en viktig parameter; Det kan enkelt kontrolleres ved hematoxylin og eosin farge.
En fordel med teknikken er muligheten for multiplex stainings, men for å unngå fluorophore smitteeffekter, anbefales det for å velge utslipp bølgelengder med delta 10 nm minimum. Her, fordi vi hadde 4 stainings inkludert DAPI, valgte vi å fordele bølgelengdene (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, Cyanine 3:570 nm, Cyanine 5:670…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Institut nasjonale du kreft (INCA) (ET) Ligue contre le kreft (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex Immuno-onkologi (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET). EdG ble finansiert av et fellesskap av Fondation bue. EV og CD ble finansiert av et fellesskap av APHP (bourse année recherche). Les er finansiert av et fellesskap av Université Sorbonne Paris Cité (contrat doktorgrad). Forfatterne takker Bristol Myers Squibb for sin finansiering i dette prosjektet. Forfatterne takker Institutt for patologi på Hopital Européen Georges Pompidou og Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel og Gisèle Legall). Forfatterne takker Histology plattformen for PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
R software | https://www.r-project.org | ||
Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24×60 mm 100 cover slips |
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |