Multiplexado imunofluorescência análise e quantificação de Intratumoral PD-1+ + Tim-3 CD8+ T células
Summary
Estudar o microambiente do tumor pode identificar biomarcadores prognósticos ou preditivos de resposta clínica à imunoterapia. Apresentado aqui, é um método inovador baseado em situ fluorescência multiespectral de imagens para analisar e contar automaticamente várias subpopulações de CD8+ T células. Esta técnica reprodutível e confiável é apropriada para análises de grandes coorte.
Abstract
Células do sistema imunológico são importantes componentes do microambiente do tumor e influenciam o crescimento do tumor e evolução em todas as fases da carcinogénese. Notavelmente, está agora bem estabelecido que o infiltrado imune em tumores humanos pode correlacionar com prognóstico e resposta à terapia. A análise do imune infiltrado no microambiente do tumor tornou-se um grande desafio para a classificação dos pacientes e a resposta ao tratamento.
A expressão co de receptores inibitórios como programa célula morte proteína 1 (PD1; também conhecido como CD279), citotóxica dos linfócitos T associado proteína 4 (CTLA-4), T-Cell imunoglobulina e mucina que contém proteína-3 (Tim-3, também conhecido como CD366) e linfócitos Gene de ativação 3 (GAL-3; também conhecido como CD223), é uma marca registrada da exaustão de célula T. Desenvolvemos uma imunofluorescência Multiparamétrico em situ coloração para identificar e quantificar a nível celular, a expressão co destes receptores inibitórios. Em uma série retrospectiva de tecido congelado de carcinomas de células renais (RCC), usar uma tecnologia de imagem multiespectral de fluorescência juntamente com um software de análise de imagem, verificou-se essa expressão co de PD-1 e Tim-3 tumor infiltrando CD8+ T células está correlacionado com um mau prognóstico na RCC. A nosso conhecimento, este representa o primeiro estudo demonstrando que este multiplex em situ tecnologia automatizada pode ter alguma relevância clínica.
Introduction
Nos últimos anos, a imunoterapia tem emergido como um tratamento muito promissor para muitos tipos de cânceres, incluindo o RCC. Particularmente, gosto de imunoterapia baseia a inibição dos postos de controlo inibitórios PD-1 e CTLA-4 foi relatado para ser clinicamente eficaz1,2,3,4,5, 6. anticorpos monoclonais contra CTLA-4, PD-1, ou programa morte ligante 1 (PD-L1) estão já aprovados em vários tipos de câncer e levar a longa duração respostas clínicas em mais de 20% dos pacientes7. No entanto, nem todos os pacientes são os respondentes, o custo do tratamento é alto, e estes tratamentos são tóxicos, levando a graves doença auto-imune, como efeitos colaterais. Portanto, o atual desafio é identificar marcadores preditivos para essas novas imunoterapias. A taxa de mutações no tumor, a expressão de PD-L1 ou os níveis de intratumoral CD8+ infiltração de células T têm sido relatados para correlacionar com a resposta clínica. No entanto, esta associação ainda é muito fraca para recomendar o uso desses biomarcadores clínicos na prática clínica, exceto para o teste de companheiro para PD-L1 antes da administração de Pembrolizumab em não-pequenas células lung cancer (NSCLC) pacientes8 ,9,1011,12. Foi demonstrado que a expressão co de muitos receptores inibitórios como PD-1, Tim-3, 3-Lag, e CTLA-4, induz um fenótipo de exaustão celular e resistência à terapia13,14,15. Desde que o sangue periférico não é representativo do microambiente do tumor, é de grande interesse para analisar as características fenotípicas das células em situ. PD-1 e Tim-3 co expressando as pilhas de T são conhecidas por serem células funcionalmente deficientes em vários contextos13,16,17. Neste estudo, o impacto prognóstico da expressão co dos dois receptores inibitórios PD-1 e Tim-3 em CD8+ T células foi avaliada.
Até agora, estudando a expressão co de vários marcadores tumor infiltrando linfócitos (TILs) tem sido realizado principalmente pela análise de citometria de fluxo, tornando-se necessário trabalhar em tumores frescos e, portanto, impedindo as análises retrospectivas. Com a coloração convencional em situ , manchando apenas um de cada vez pode ser executada, e a caracterização do tipo de célula que co expressa os marcadores não é possível. Por exemplo, PD-L1 é expressa por muitos tipos de células do microambiente tumoral, tornando-se difícil definir por análise imuno-histoquímica convencionais quais células expressando PD-L1 são os mais relevantes para estudos correlativos. Neste trabalho, desenvolvemos um método inovador em situ Multiparamétrico imunofluorescência com contagem de computador correlacionar a expressão co de PD-1 e Tim-3 pelo tumor infiltrando CD8 + T-células com desfechos clínicos na RCC. Esta técnica tem várias vantagens, incluindo a possibilidade de analisar em um nível de célula única e vários marcadores ao mesmo tempo usando uma câmera multiespectral que pode capturar intervalos restritos > 10 nm através de cristal líquido filtra18. Além disso, o procedimento é automático que permite que um operador inter reprodutibilidade e uma análise reduzida em comparação com técnicas manuais19. No campo do câncer, diversos estudos relataram convincente várias colorações de moléculas imunes como PD-1, PD-L1 e CD8 em células de Merkel carcinoma, câncer de pulmão e cabeça e pescoço câncer20,21,22, 23. a contagem automatizada de células é possível com treinamento pelo usuário (etapa de fenotipagem). A fluorescência é medida nos compartimentos diferentes células (núcleos, citoplasma e membrana).
Aqui, os diferentes subconjuntos de tumor infiltrando CD8+ T células expressando PD-1 e/ou Tim-3 em uma grande coorte de RCC foram contados e os resultados foram correlacionados com escores de gravidade clínica e parâmetros de sobrevivência. Também foi possível analisar a intensidade de fluorescência da membrana na resolução do celular com dados de intensidade de fluorescência dizer (IFM) como em citometria. Tanto quanto sabemos, isto representa os primeiro estudo relatórios prognóstico resultados usando esta técnica de contagem com base de imagens multiespectrais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modificações e solução de problemas:
A qualidade do tecido é um parâmetro importante; Isso pode ser facilmente verificado pela coloração de hematoxilina e eosina.
Uma vantagem da técnica é a possibilidade de colorações multiplexadas, mas para evitar repercussões fluoróforo, recomendado para escolher com delta de no mínimo 10 nm, comprimentos de onda de emissão. Aqui, porque nós tivemos 4 colorações incluindo DAPI, escolhemos a esp…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por concessões do Institut National du Cancer (INCA) (ET), Ligue contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex imuno-Oncologia (ET), CARPEM SIRIC (CG, ET). EdG foi financiado por uma bolsa da Fundação arco. EV e CD foram financiados por uma irmandade do PHP (bourse année recherche). ChB é financiado por uma bolsa da Université Sorbonne Paris Cité (contrat doutorado). Os autores graças a Bristol Myers Squibb para seu financiamento neste projeto. Os autores agradecer ao departamento de patologia do Hopital Européen Georges Pompidou e Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel e Gisèle Legall). Os autores graças a plataforma de histologia de PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).
Materials
| Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
| inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
| R software | https://www.r-project.org | ||
| Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
| Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
| Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
| Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
| normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
| Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24×60 mm 100 cover slips |
| Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
| Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
| Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
| Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
| Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
| Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
| Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
| Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
| Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
| Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
| negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
| IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
| IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |
Riferimenti
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