Her beskriver vi teknikken av sputum induksjon. Denne protokollen forklarer også sputum behandling å utføre en differensiell celletall og samle sputum supernatant og celler for videre analyse.
Teknikken av sputum induksjon og behandling er en anerkjent ikke-invasiv metode slik at innsamling og analyse av celler fra luftveiene, som er interessant i ulike respiratoriske sykdommer som astma, kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), kronisk hoste eller idiopatisk lungefibrose. Denne teknikken er godt tolerert, trygt og ikke-invasiv, men er foreløpig begrenset til oppslagstjenester og spesialiserte sentre i klinisk praksis fordi det er teknisk krevende, tidkrevende og krever opplært personale. Suksessrate på sputum induksjon og analyse er ca 80%.
Her beskriver vi induksjon og laboratoriet behandlingen av sputum prøver. Sputum er indusert av innånding hypertonic eller isotonic saltoppløsning med salbutamol. Behandlingen bruker vi hele sputum teknikken. Dithiothreitol (DTT) brukes til å tillate mucolysis av sputum prøver. Hovedmålet med sputum behandling er å oppnå en differensiell celletall å studere i celletyper tilstede i airway lumen. Flere analyser kan også utføres på sputum supernatant og sputum celler, som kan tillate ytterligere undersøkelse i inflammatoriske prosesser og immun mekanismer. Studere meklarar i sputum supernatant og utføre et stort spekter av analyse på sputum celler som flowcytometri, genomics eller Proteomikk eksempler.
Til slutt, representant resultatene av sputum analyse i sunn kontroller, astmatikere og COPD pasienter presenteres.
Flere metoder brukes til å undersøke airway betennelse: direkte målinger (som bronchial biopsier eller bronchoalveolar lavages) og indirekte metoder (som symptom vurdering, blod prøve analyse og lunge-funksjon tester)1. Direkte teknikker har fordelen av pålitelig vurdere airway betennelse, men de er invasive og ikke gjennomførbart i stor skala på grunn av tålmodig ubehag og risikoen som1. Som for de indirekte metodene korrelerer de dårlig med direkte vurdering av airway betennelse1.
Sputum samling er en annen måte å prøve celler fra luftveiene og tillater direkte vurdering av airway betennelse. Likevel produsere sputum spontant kan føre til eksempler på dårlig kvalitet og er ikke mulig for alle pasienter2. Dette problemet er løst ved hjelp av ultrasonically nebulized hypertonic saltvann for å indusere sputum produksjon2. Denne metoden ble opprinnelig brukt hos pasienter infisert med humant immunsviktvirus (HIV) for diagnostisering av Pneumocystis carinii lungebetennelse3 og er tilrettelagt for friske og astmatikere i 19924. Sputum induksjon er også mulig i mer alvorlig pasienter ved hjelp av isotonic saltvann5. Selv om det er generelt godt tolerert, kan innånding saltoppløsning forårsake bronkospasme hos pasienter med hyperresponsive airways5. Det anbefales derfor å administrere en kort-fungerende beta Agonistiske før prosedyren1. Dessuten, vi har tidligere vist at å legge til salbutamol saltvann i den ultrasoniske forstøveren ytterligere redusert denne risikoen6. Fordelene med sputum induksjon er at det er ikke-invasiv2 og trygt når passende forholdsregler er tatt5.
For behandling av sputum eksempler, to metoder som brukes i litteraturen: hele sputum teknikken og plug utvalg7. I vårt laboratorium utføres hele sputum teknikken. Hovedmålet med sputum behandling er å oppnå en differensiell celletall å studere av betennelse i luftveiene lumen. Men mange flere analyser er også mulig å undersøke nærmere inflammatoriske prosesser og immun mekanismer, enten ved å studere meglere i sputum supernatant8 eller ved å utføre detaljert undersøkelse på sputum celler (f.eks , flow cytometri9celle kulturer10genomics10, Proteomikk10, immunocytochemistry7, i situ hybridisering7, etc.)
Teknikken av sputum induksjon og analyse er foreløpig begrenset til forskning tjenester og spesialiserte sentre i klinisk praksis fordi det er teknisk krevende, tidkrevende og krever opplært personale1. Airway betennelse kan undersøkes med denne metoden for ulike respiratoriske sykdommer som astma, kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), kronisk hoste eller idiopatisk lungefibrose11.
Metoden indusert sputum er et nyttig verktøy å studere airway batterirommet. Det er flere mulige anvendelser av denne teknikken. Først, kan det forbedre kunnskap om immunceller og mekanismer involvert i ulike luftveissykdommer. For eksempel, denne teknikken har tillatt etterforskningen av airway betennelse i store kohorter av pasienter, og det har vist at rundt halvparten av astmatisk pasienter er preget av en unormal airway eosinophilic betennelse15, 16 , 17, mens COPD pasienter vanligvis viser en hevet sputum nøytrofile telle18. Denne teknikken har også bidratt til å bedre karakteristikk av airway betennelse hos pasienter med idiopatisk lungefibrose og bevis meglere som kan bidra til denne sykdommen19. Andre kan teknikken av indusert sputum være nyttig å forutsi respons på behandling. Tilstedeværelsen av en unormal sputum eosinofile har for eksempel vist å være en prediktiv markør kortikosteroid respons11,18. Astma og KOLS, ble skreddersy dosen av corticosteroids normalisere andelen sputum eosinofile vist å være mer effektive i å redusere antall eksaserbasjoner enn justere behandling i henhold til gjeldende kliniske retningslinjer11 ,20,21. Tredje kan sputum analyse bidra til å utvikle målrettet terapi. For eksempel har tilstedeværelsen av en uvanlig antall sputum nøytrofile COPD og noen astmatisk pasienter ført til utviklingen av antineutrophilic behandlinger11. Fjerde kan teknikken spille en rolle i diagnose. For eksempel er tilstedeværelsen av sputum eosinophilia nødvendig å stille en diagnose av ikke-astmatiske eosinophilic bronkitt11.
Foruten en differensiell celletall, innrømmer teknikken av inducing sputum likeledes ytelsen til mange flere analyser, ved å studere sputum supernatant eller sputum celler. Analyse av meglere8,19,22 og vurdering av chemotactic aktiviteten til utvalget for eosinofile22er eksempler med sputum supernatant. Sputum celler, RNA kan trekkes ut og brukes for microRNA eller genuttrykk analyserer19,23 . Sputum cellene kan også analyseres ved flyt cytometri9,23 som tillater, blant annet immunophenotyping og sortere celler. Videre sputum celler kan være kulturperler10, og mellommann produksjonen kan måles i vitro24. Det er verdt å merke seg at i dette tilfellet, megler innholdet er forskjellig fra hva kan finnes i sputum supernatant. Meklarar i sputum supernatant kan faktisk bli påvirket av sekret fra airway bosatt celler og plasma exudation, i motsetning til de sputum celle kultur modell24. Til slutt, immunocytochemistry og i situ hybridisering også utføres med sputum celler7.
Indusert sputum teknikken har noen begrensninger. Induksjon må utføres under medisinsk tilsyn. Det er også viktig for operatøren å gi nøyaktige instruksjoner til pasienter. Andre begrensninger omfatter samarbeid og medisinsk tilstand av pasienter, som åndedretts innsats er nødvendig. Hensyn til gjennomførbarheten av denne teknikken i barn, flere studier har rapportert at det var vellykket og trygt i barn eldre enn 6 år25. Data om barn av < 6 år mangler25, men det er sannsynlig at sputum induksjon er vanskelige å utføre i disse barn14. Teknikken er begrenset til forskning tjenester og spesialiserte sentre fordi det er teknisk krevende, tidkrevende, og det krever opplært personale1. En annen begrensning er at teknikken av sputum induksjon og analyse ikke er alltid lykkes, betyr at en lesbar cytospin ikke er alltid fått26. Men er suksessraten vanligvis rundt 80% i forskjellige kohorter pasienter,4,,26,,27,,28,,29. Endelig må forsiktighet tas når man sammenligner forskjellige kohorter av pasientene om den tilsvarende alder som det ble vist å påvirke sputum celle teller30,31. Likeledes har andre parametere som kjønn og tobakk samkjøres som de også kan påvirke sputum celle teller29,32. Når pasienten matchende ikke er mulig, er en annen måte å ta hensyn til alder, kjønn eller røyking status å justere den statistiske analysen for disse egenskapene.
Sammenlignet med andre teknikker som tillater samle celler fra airways, som biopsier og bronchoalveolar lavages, har indusert sputum metoden fordelene av å være enkel, godt tolerert, sikker, reproduserbare, kostnadseffektiv og ikke-invasiv. Disse fordelene kan indusert sputum teknikken utføres i stor skala og gjentatte ganger over tid, og gjøre det et alternativ valg for airway prøvetaking. Bronchosorption er en annen teknikk slik at samlingen av slimhinnene slimhinnen væske for å vurdere airway meglere33. Mens denne teknikken (krever bronkoskopi) er mer invasiv enn indusert sputum, har fordelene av unngå enhver kontaminering med spytt og oppnå høyere konsentrasjoner av meglere enn bronchoalveolar lavage33.
Avgjørende skritt trenger oppmerksomhet i protokollen. Forsiktighet må først tas opp om saltvann konsentrasjon og tidspunktet for induksjon, fordi disse to parametere kan påvirke resultatene og må derfor være standardisert34,35. Andre er mucolysis med DTT et viktig skritt i behandling. Sammenlignet med PBS, ble DTT vist å bedre spre sputum celler7, som forbedrer cytopsin lysbilde kvaliteten og er viktig å ha en reproduserbar celle teller2. Mucolytic agent kan imidlertid forstyrre målingen av biokjemiske komponenter.Skyter eksperimenter skal deretter utføres når du måler en ny biokjemiske sammensatte36. Til slutt, en annen viktig trinn i fremgangsmåten er cellen teller trinn som må utføres av en tekniker å sikre pålitelig og interpretable resultater.
En alternativ metode med sputum plugger (seigtflytende eller tettere deler), i stedet for hele sputum, er også beskrevet i litteraturen7. Begge teknikkene har fordeler og ulemper. Hele sputum teknikken tillater raskere behandling7, men er ofte forurenset med spytt, som utvanner prøven og kan redusere kvaliteten på cytospins2,7. Med plug utvalg teknikken, er spytt forurensning redusert, noe som betyr at prøvene er ofte av bedre kvalitet for dosering av flytende fase meglere og cytospin lysbilder7. Behandlingen er imidlertid lengre7 valgte plugger kan ikke representant for hele prøven37. Det er også verdt å merke seg at ikke alle prøver inneholder plugger, som kan være begrensende. Begge metodene er validert og reproduserbare, og det er ingen bevis for at de differensial celletall fra begge disse metodene er forskjellige14,38.
I fremtiden, kan indusert sputum brukes som et klinisk verktøy for å gi biomarkers for etterforskning, diagnose og behandling av alle typer inflammatorisk luftveissykdommer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av universitetet sykehus i Liege (CHU Liege). Vi erkjenner “Instants produksjoner” for video produksjon. Vi erkjenner også Cedric François, pasienten som dukket opp i filmen.
Spirometer – Spirobank | MIR France | ||
Salbutamol MDI – Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0135-913 | See drug available in the country |
Nebulizer UltraNeb | DeVilbiss Healthcare USA | UltraNeb U3000 | |
Devilbiss UltraNeb Disposable Cups & Lids | DeVilbiss Healthcare USA | 100HD-647 | |
DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers | DeVilbiss Healthcare USA | 1001005879 | |
One-way Valves | Hudson RCI USA | 41664 | |
One-way Valves | Hudson RCI USA | 41665 | |
Aerosol T-connector | Hudson RCI USA | 41077 | |
Ventilation circuit monobranch corrugated | Int'Air Medical France | TA30A | |
NaCl 5 % | / | / | Produced by our hospital pharmacy |
Mini-Plasco NaCl 0.9% | B.Braun Medical Diegem Belgium | ||
Salbutamol sulfate 5 mg/mL – Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0094-987 | See drug available in the country |
Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL – Atrovent | Boehringer Ingelheim Germany | CNK: 1543-305 | See drug available in the country |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | LONZA Belgium | BE17512F | |
Sputolysin reagent | Calbiochem | 56000 | |
Trypan blue 0.4% solution 100 mL | LONZA Bio Whittaker Belgium | 17-942E | |
Hemocytometer – Thoma chamber | Labor Optik Lancing UK | 1500000 | |
Hemacolor Stainig set | Merck Belgium | 1116610001 | Alternative product : Diff Quik Staining Set Medion Diagnostic |
Mounting medium – Entellan | Merck Belgium | 107960 | |
Statspin Cytofuge 12 | Beckman Coulter Belgium | X00-003066-001 |