Hier beschrijven we de techniek van sputum inductie. Dit protocol legt ook uit het sputum verwerking voor het uitvoeren van een telling van de differentiële cel en voor het verzamelen van sputum supernatant en cellen voor verdere analyse.
De techniek van sputum inductie en verwerking is een erkende niet-invasieve methode waardoor het verzamelen en analyseren van de cellen van de luchtwegen, die interessant is in verschillende respiratoire aandoeningen zoals astma, chronische obstructieve longziekte (COPD), chronische hoest, of idiopathische longfibrose. Deze techniek is goed getolereerd, veilig en niet-invasieve, maar is momenteel beperkt tot onderzoeksservices en gespecialiseerde centra in de klinische praktijk, omdat het technisch veeleisende en tijdrovende, en opgeleid personeel vereist. Het slagingspercentage van sputum inductie en analyse is ongeveer 80%.
Hier beschrijven we de inductie en laboratorium verwerking van sputum monsters. Sputum wordt geïnduceerd door inademing hypertonic of isotone zoutoplossing met salbutamol. Voor de verwerking gebruiken we de hele sputum-techniek. Dithiothreitol (DTT) wordt gebruikt om mucolysis van sputum monsters. Het primaire doel van sputum verwerking is te verkrijgen van een aantal van de differentiële cel om te bestuderen van de celtypes aanwezig in de luchtweg lumen. Aanvullende analyses kunnen ook op sputum supernatant en sputum cellen, die verder onderzoek naar inflammatoire processen en immuun mechanismen kunnen worden uitgevoerd. Voorbeelden van bemiddelaars/mediators in sputum supernatant bestuderen en uitvoeren van een groot spectrum van analyse op sputum cellen zoals stroom cytometry genomics en proteomics.
Ten slotte, representatieve resultaten van sputum analyse in gezonde controles, asthma en COPD patiënten worden gepresenteerd.
Verschillende methoden zijn gebruikt om de onderzoeken van de luchtweg ontsteking: directe metingen (zoals bronchiale biopsieën of bronchoalveolar lavages) en indirecte methoden (zoals symptoom evaluatie, bloed monster analyse en Long functie test)1. De directe technieken hebben het voordeel dat het betrouwbare beoordeling van de ontsteking van de luchtwegen, maar ze zijn invasieve en niet haalbaar op grote schaal vanwege patiënt ongemak en het risico gemaakte1. Wat betreft de indirecte methoden correleren zij slecht met de directe beoordeling van de luchtweg ontsteking1.
Sputum-collectie is een andere manier naar monster cellen van de luchtwegen en laat de directe beoordeling van ontsteking van de luchtwegen. Echter het produceren van sputum spontaan kan leiden tot monsters van slechte kwaliteit en is niet mogelijk voor alle patiënten2. Dit probleem is verholpen met behulp van corrosiebestendige nebulized hypertonic saline ertoe het sputum productie2. Deze methode werd aanvankelijk gebruikt bij patiënten besmet met humaan immunodeficiëntie virus (HIV) voor de diagnose van Pneumocystis carinii pneumonie3 en werd aangepast voor gezonde proefpersonen en astmapatiënten in 19924. Sputum-inductie is ook haalbaar in meer ernstige patiënten met behulp van isotone zoutoplossing5. Hoewel over het algemeen goed verdragen, kan het inademen zoutoplossing bronchospasme bij patiënten met hyperresponsive airways5kan veroorzaken. Daarom is het aanbevolen om het beheren van een korte-acteren Bèta agonist vóór de procedure1. Wij hebben bovendien eerder getoond dat salbutamol toe te voegen aan de zoutoplossing in de ultrasone vernevelaar verder dit risico6 daalde. De voordelen van sputum inductie is dat er niet-invasieve2 en veilig wanneer passende voorzorgen zijn genomen5.
Voor de verwerking van sputum monsters, de twee methoden worden momenteel gebruikt in de literatuur: de hele sputum-techniek en de plug selectie7. In ons laboratorium, wordt de hele sputum techniek uitgevoerd. Het primaire doel van sputum verwerking is te verkrijgen van een aantal van de differentiële cel om te bestuderen van het type ontsteking aanwezig in de luchtweg lumen. Veel aanvullende analyses zijn echter ook mogelijk om andere te onderzoeken inflammatoire processen en immuun mechanismen, ofwel door het bestuderen van bemiddelaars/mediators in het sputum supernatant8 of door het uitvoeren van gedetailleerde onderzoek van sputum cellen (bv , stroom cytometry9cel culturen10genomics10, proteomics10, immunocytochemie7, in situ hybridisatie7, enz.)
De techniek van sputum inductie en analyse is momenteel beperkt tot het onderzoek van diensten en gespecialiseerde centra in de klinische praktijk, omdat het technisch veeleisende en tijdrovende, en opgeleid personeel1vereist. Deze methode voor verschillende respiratoire aandoeningen zoals astma, chronische obstructieve longziekte (COPD), chronische hoest of idiopathische longfibrose11kan ontsteking van de luchtwegen worden onderzocht.
De geïnduceerde sputum-methode is een nuttig instrument om te studeren het compartiment van de luchtwegen. Er zijn meerdere mogelijke toepassingen van deze techniek. Eerst, kan het verbeteren van kennis over immuuncellen en mechanismen die betrokken zijn bij verschillende aandoeningen van de luchtwegen. Bijvoorbeeld, deze techniek heeft het onderzoek van de luchtweg ontsteking in grote cohorten van patiënten toegestaan, en het heeft aangetoond dat ongeveer de helft van astmatische patiënten worden gekenmerkt door een abnormale airway eosinofiel ontsteking15, 16 , 17, terwijl COPD patiënten vertonen meestal een verhoogde sputum neutrofiele tellen18. Deze techniek heeft ook bijgedragen aan betere karakterisering van luchtweg ontsteking bij patiënten met idiopathische longfibrose en bewijs bemiddelaars die aan deze ziekte19 bijdragen kunnen. Ten tweede, de techniek van geïnduceerde sputum kan zinvol te voorspellen reactie op behandeling. Bijvoorbeeld, de aanwezigheid van een abnormale percentage van sputum eosinofielen gebleken te zijn van een voorspellende marker van corticosteroïd responsiviteit11,18. In astma en COPD, werd aanpassing van de dosis van corticosteroïden te normaliseren van het percentage van sputum eosinofielen getoond om meer effectief in het verminderen van het aantal exacerbaties dan het aanpassen van de behandeling volgens de huidige klinische richtlijnen11 2120, ,. Ten derde, sputum analyse kan bijdragen tot het ontwikkelen van gerichte therapieën. Bijvoorbeeld, heeft de aanwezigheid van een abnormaal aantal sputum neutrofielen in COPD en sommige astmatische patiënten geleid tot de ontwikkeling van antineutrophilic behandelingen11. Ten vierde, de techniek kan spelen een rol in diagnose. Bijvoorbeeld, is de aanwezigheid van sputum eosinofilie nodig om een diagnose van niet-astmatische eosinofiel bronchitis11.
Naast het verkrijgen van een gedifferentieerde cel telling, de techniek van het inducerende sputum ook toe de prestaties van veel extra analyses, door het bestuderen van sputum bezinken of sputum cellen. Voorbeelden met sputum supernatant zijn de analyse van bemiddelaars/mediators8,19,22 en de beoordeling van de Chemotactische activiteit van het monster voor eosinofielen22. Uit sputum cellen, RNA kan worden geëxtraheerd en kan worden gebruikt voor microRNA of genexpressie analyseert19,23 . De cellen van sputum kunnen ook door stroom cytometry9,23 waarmee, o.a. immunophenotyping en sorteren van cellen worden geanalyseerd. Bovendien, sputum cellen kunnen gekweekte10, en hun productie bemiddelaar kan worden gemeten in vitro24. Het is vermeldenswaard dat in dit geval, de inhoud van de bemiddelaar is verschillend van wat kan worden gevonden in sputum bezinken. Bemiddelaars in sputum supernatant kunnen inderdaad, worden beïnvloed door afscheidingen uit resident cellen van de luchtwegen en plasma afscheiding, in tegenstelling tot de sputum cel cultuur model24. Ten slotte kan immunocytochemie en in situ hybridisatie ook worden uitgevoerd met behulp van sputum cellen7.
De geïnduceerde sputum techniek kent een aantal beperkingen. De inductie moet onder medisch toezicht worden uitgevoerd. Het is ook essentieel voor de exploitant om grondige instructies aan patiënten geven. Andere beperkingen omvatten de samenwerking en de medische conditie van patiënten, zoals respiratoire inspanningen nodig zijn. Met betrekking tot de haalbaarheid van deze techniek bij kinderen, verschillende studies hebben gemeld dat het was succesvol en veilig bij kinderen ouder dan 6 jaar oud25. Gegevens over kinderen van < 6 jaar ontbreken25, maar het is waarschijnlijk dat sputum inductie is moeilijk uit te voeren in die kinderen14. De techniek is momenteel beperkt tot het onderzoek van diensten en gespecialiseerde centra, omdat het technisch veeleisende en tijdrovende, en het vereist opgeleid personeel1. Een andere beperking is dat de techniek van sputum inductie en analyse niet altijd succesvol is, wat betekent dat een leesbaar cytospin26niet altijd is verkregen. Het slagingspercentage is echter meestal ongeveer 80% in de verschillende cohorten van patiënten4,26,27,28,29. Tot slot moet voorzichtigheid worden genomen bij het vergelijken van de verschillende cohorten van patiënten met betrekking tot de onderlinge afstemming van leeftijd zoals het bleek om de impact van de sputum cel tellen30,31. Ook hebben andere parameters zoals geslacht en tabak gewoonten gepaard gaan als zij ook met de sputum cel graaf29,32 interfereren kunnen. Wanneer patiënten matching niet mogelijk is, is een andere manier om het rekening houden met leeftijd, geslacht of roken status aan te passen van de statistische analyse voor deze eigenschappen.
In vergelijking met andere technieken waarmee de cellen verzamelen van airways, zoals biopsieën en bronchoalveolar de lavages, kent de geïnduceerde sputum-methode de voordelen van het eenvoudige, goed verdragen, veilige, reproduceerbaar, kosteneffectieve en niet-invasieve. Deze voordelen toestaan de geïnduceerde sputum techniek moet worden uitgevoerd op een grote schaal en herhaaldelijk na verloop van tijd, en het alternatief bij uitstek voor bemonstering van de luchtwegen. Bronchosorption is een andere techniek waardoor de collectie van de mucosal voering vloeistof teneinde airway bemiddelaars33. Hoewel deze techniek (vereisen bronchoscopie) meer invasief dan geïnduceerde sputum is, heeft de voordelen van het vermijden van verontreiniging met speeksel en het verkrijgen van hogere concentraties van bemiddelaars dan in bronchoalveolar lavage33.
Kritische stappen nodig aandacht in het protocol. Eerst, moet voorzichtigheid worden genomen betreffende de zoute concentratie en het tijdstip van inductie, omdat deze twee parameters kunnen de resultaten beïnvloeden en moeten dus gestandaardiseerd34,35. Ten tweede, de mucolysis met DTT is een belangrijke stap van de verwerking. Ten opzichte van PBS, werd DTT aangetoond dat het sputum cellen7, dat verbetert de kwaliteit van de dia cytopsin en is absoluut noodzakelijk dat er een reproduceerbare cel tellen2beter te verspreiden. Echter kan het slijmoplossende agent interfereren met de meting van biochemische onderdelen.Stekelige experimenten moet worden uitgevoerd bij het meten van een nieuwe biochemische samengestelde36. Tot slot is een andere kritische stap van de procedure de cel stap, die moet worden uitgevoerd door een opgeleide technicus om betrouwbare en interpreteerbaar resultaten tellen.
Een alternatieve methode met behulp van sputum stekkers (viscid of dichtere delen), in plaats van het hele sputum, wordt ook beschreven in de literatuur7. Beide technieken hebben voor- en nadelen. De hele sputum techniek kunt sneller verwerken van7, maar is vaak besmet met speeksel, die verdunt het monster en de kwaliteit van cytospins2,7kan verminderen. Met de plug selectie techniek, wordt de speeksel-verontreiniging verminderd, hetgeen betekent dat de monsters vaak van betere kwaliteit voor de dosering van vloeibare fase bemiddelaars en cytospin dia’s7 zijn. De verwerking is echter langer7 en geselecteerde pluggen kunnen niet representatief zijn voor de gehele monster37. Het is ook vermeldenswaard dat niet alle monsters bevatten stekkers, die kunnen worden beperkt. Beide methoden zijn gevalideerde en reproduceerbaar is, en er is momenteel geen bewijs dat de graven van de differentiële cel verkregen van beide methoden verschillende14,,38 zijn.
Geïnduceerde sputum kan in de toekomst worden gebruikt als een klinische instrument waarmee biomarkers voor het onderzoek, diagnose en beheer van allerlei inflammatoire aandoeningen van de luchtwegen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de Universiteit ziekenhuis van Luik (CHU Luik). Wij erkennen “Instants productions” voor de videoproductie. We erkennen ook Cedric François, de patiënt die in de film verscheen.
Spirometer – Spirobank | MIR France | ||
Salbutamol MDI – Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0135-913 | See drug available in the country |
Nebulizer UltraNeb | DeVilbiss Healthcare USA | UltraNeb U3000 | |
Devilbiss UltraNeb Disposable Cups & Lids | DeVilbiss Healthcare USA | 100HD-647 | |
DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers | DeVilbiss Healthcare USA | 1001005879 | |
One-way Valves | Hudson RCI USA | 41664 | |
One-way Valves | Hudson RCI USA | 41665 | |
Aerosol T-connector | Hudson RCI USA | 41077 | |
Ventilation circuit monobranch corrugated | Int'Air Medical France | TA30A | |
NaCl 5 % | / | / | Produced by our hospital pharmacy |
Mini-Plasco NaCl 0.9% | B.Braun Medical Diegem Belgium | ||
Salbutamol sulfate 5 mg/mL – Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0094-987 | See drug available in the country |
Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL – Atrovent | Boehringer Ingelheim Germany | CNK: 1543-305 | See drug available in the country |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | LONZA Belgium | BE17512F | |
Sputolysin reagent | Calbiochem | 56000 | |
Trypan blue 0.4% solution 100 mL | LONZA Bio Whittaker Belgium | 17-942E | |
Hemocytometer – Thoma chamber | Labor Optik Lancing UK | 1500000 | |
Hemacolor Stainig set | Merck Belgium | 1116610001 | Alternative product : Diff Quik Staining Set Medion Diagnostic |
Mounting medium – Entellan | Merck Belgium | 107960 | |
Statspin Cytofuge 12 | Beckman Coulter Belgium | X00-003066-001 |