Här beskriver vi tekniken av sputum induktion. Detta protokoll förklarar också sputum bearbetning att utföra en differential cell sammanräkning och samla sputum supernatanten och celler för vidare analys.
Tekniken att sputum induktion och bearbetning är en erkänd icke-invasiv metod som möjliggör insamling och analys av celler från luftvägarna, vilket är intressant i olika luftvägssjukdomar som astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom (kol), kronisk hosta, eller idiopatisk lungfibros. Denna teknik är väl tolererad, säker och icke-invasiv, men är för närvarande begränsad till forskningstjänster och specialiserade centra i klinisk praxis eftersom det är tekniskt krävande, tidskrävande och kräver utbildad personal. Andelen framgångsrika sputum induktion och analys är ca 80%.
Här beskriver vi induktion och laboratorium bearbetning av sputum prover. Sputum induceras genom inhalation av hyperton eller isoton koksaltlösning med salbutamol. För bearbetning använder vi hela sputum tekniken. Ditiotreitol (DTT) används för att tillåta mucolysis av sputum prover. Det primära syftet med sputum bearbetning är att erhålla en differential cell sammanräkning för att studera celltyper som finns i luftvägarna lumen. Ytterligare analyser kan också utföras på sputum supernatanten och sputum celler, som kan tillåta ytterligare utredning inflammatoriska processer och immunologiska mekanismer. Till exempel studerar mediatorer i sputum supernatanten och utför ett stort spektrum av analys på sputum celler såsom flödescytometri, genomik och proteomik.
Slutligen presenteras representativa resultat av sputum analys i friska kontroller, astmatiker och KOL-patienter.
Flera metoder används för att undersöka luftvägsinflammationer: direkta mätningar (som bronkial biopsier eller bronkoalveolär lavages) och indirekta metoder (som symptom bedömning, blod prov analys och lung funktionstester)1. De direkta teknikerna har fördelen av att på ett tillförlitligt sätt bedöma inflammationen i luftvägarna, men de är invasiva och inte genomförbart i stor skala på grund av patientens obehag och risk uppkommer1. När det gäller de indirekta metoderna korrelerar de dåligt med direkt bedömning av luftvägarna inflammation1.
Sputum collection är ett annat sätt att provet celler från luftvägarna och tillåter direkt bedömning av inflammation i luftvägarna. Dock producera sputum spontant kan leda till prover av dålig kvalitet och är inte möjligt för alla patienter2. Denna fråga har övervunnits med hjälp av ultraljud nebulized hyperton koksaltlösning för att framkalla den slem produktion2. Denna metod användes initialt till patienter infekterade med humant immunbristvirus (HIV) för diagnos av Pneumocystis carinii pneumoni3 och anpassades för friska och astmatiker i 19924. Sputum induktion är också möjligt i allvarligare patienter med isoton koksaltlösning5. Även om det är i allmänhet tolereras väl, kan inandning av saltlösning orsaka bronkospasm hos patienter med hyperreaktivitet airways5. Därför är det rekommenderat att administrera en kortverkande beta agonist före förfarande1. Dessutom har vi tidigare visat att lägga till salbutamol i saltlösning i ultraljud nebulisatorn ytterligare minskat denna risk6. Fördelarna med sputum induktion är att det är icke-invasiv2 och säkra när de lämpliga försiktighetsåtgärder vidtas5.
För bearbetning av sputum prover, två metoder används för närvarande i litteraturen: hela sputum tekniken och plugg urval7. I vårt laboratorium utförs hela sputum tekniken. Det primära syftet med sputum bearbetning är att erhålla en differential cell sammanräkning för att studera vilken typ av inflammation i luftvägarna lumen. Många ytterligare analyser är dock också möjligt att ytterligare utreda inflammatoriska processer och immunologiska mekanismer, antingen genom att studera medlare i sputum supernatant8 eller genom att utföra detaljerade undersökningen på sputum celler (t.ex. , flow flödescytometri9, cell kulturer10, genomik10, proteomik10, immuncytokemi7, i situ hybridisering7, etc.)
Tekniken att sputum induktion och analys är för närvarande begränsad till forskning tjänster och specialiserade centra i klinisk praxis eftersom det är tekniskt krävande, tidskrävande och kräver utbildad personal1. Inflammation i luftvägarna kan undersökas med denna metod för olika luftvägssjukdomar som astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom (kol), kronisk hosta eller idiopatisk lungfibros11.
Metoden inducerad sputum är ett användbart verktyg att studera luftvägarna facket. I området i närheten finns det flera möjliga tillämpningar av denna teknik. Det första kan förbättra kunskapen om immunceller och mekanismer som är involverade i olika luftvägssjukdomar. Exempelvis denna teknik har tillåtit utredningen av inflammation i luftvägarna i stora kohorter av patienter, och det har visat att ungefär hälften av astmatiska patienter kännetecknas av en onormal luftvägarna eosinofil inflammation15, 16 , 17, medan KOL-patienter uppvisar vanligen upphöjda sputum neutrofiler räkna18. Denna teknik har också bidragit till bättre karakterisering av luftvägsinflammationer hos patienter med idiopatisk lungfibros och bevis medlare som kan bidra till denna sjukdom19. Andra kan tekniken med inducerad sputum vara användbart för att förutsäga behandlingssvaret. Förekomsten av en onormal andel av sputum eosinofiler har till exempel visat sig vara en prediktiv markör kortikosteroid lyhördhet11,18. I astma och kol visade skräddarsy dosen av kortikosteroider att normalisera procentandelen av sputum eosinofiler sig vara mer effektiva för att minska antalet exacerbationer än justera behandling enligt de aktuella kliniska riktlinjerna11 ,20,21. För det tredje, sputum analys kan hjälpa till att utveckla riktade terapier. Exempelvis har förekomsten av ett abnormt antal sputum neutrofiler i kol och vissa astmatiska patienter lett till utvecklingen av antineutrophilic behandlingar11. Fjärde, tekniken kan spela en roll i diagnos. Förekomsten av sputum eosinofili är exempelvis nödvändigt att göra en diagnos av icke-astmatiska eosinofil bronkit11.
Utöver att få en differential cell sammanräkning, gör tekniken inducera sputum också utförandet av många ytterligare analyser, genom att studera antingen sputum supernatant eller sputum celler. Med sputum supernatant exempel analys av medlare8,19,22 och bedömningen av provet för eosinofiler22kemotaktisk verksamhet. Från sputum celler, RNA kan extraheras och används för mikroRNA eller genuttrycket analyseras19,23 . Sputum cellerna kan också analyseras genom flödet flödescytometri9,23 som tillåter, bland andra immunophenotyping och sortering celler. Dessutom sputum celler kan vara odlade10, och deras medlare produktion kan vara mätt in vitro-24. Är det värt att notera att i detta fall är medlare innehållet skiljer sig från vad som kan hittas i sputum supernatant. Medlare i sputum supernatant kan faktiskt vara influerad av sekret från luftvägarna bosatt celler och plasma exsudation, tvärtemot den sputum cell kultur modell24. Immuncytokemi och i situ hybridisering kan slutligen också utföras med sputum celler7.
Inducerad sputum tekniken har vissa begränsningar. Induktionen måste utföras under medicinsk övervakning. Det är också viktigt för operatören att ge noggranna instruktioner till patienter. Andra begränsningar är samarbetet och medicinska tillståndet hos patienter, eftersom luftvägarna insatser behövs. När det gäller genomförbarheten av denna teknik i barn, flera studier har rapporterat att det var framgångsrik och trygg hos barn äldre än 6 år gammal25. Uppgifter om barn i < 6 år saknas25, men det är troligt att sputum induktion är svårt att utföra i dessa barn14. Tekniken är för närvarande begränsad forskning tjänster och specialiserade centra eftersom det är tekniskt krävande, tidskrävande och kräver utbildad personal1. En annan begränsning är att tekniken av sputum induktion och analys inte är alltid lyckas, vilket innebär att en läsbar cytospin inte alltid erhålls26. Framgång är dock vanligtvis runt 80% i olika kohorter av patienter4,26,27,28,29. Slutligen måste vara försiktig när man jämför olika kohorter av patienter avseende den matchande ålder som det visades att påverka sputum cell count30,31. Likaså har andra parametrar såsom kön och tobak vanor matchas som de kan också störa den sputum cell count29,32. När patienten matchningen inte är möjligt, är ett annat sätt att ta hänsyn till ålder, kön eller rökstatus att justera den statistiska analysen för dessa egenskaper.
Metoden inducerad sputum jämfört med andra tekniker som gör att samla celler från luftvägarna, som biopsier och bronkoalveolär lavages, och har fördelar av att vara enkel, väl tolererad, säker, reproducerbara, kostnadseffektiva och icke-invasiv. Dessa fördelar kan inducerad sputum tekniken ska utföras i stor skala och upprepade gånger över tid och göra det ett alternativ i valet för luftvägarna provtagning. Bronchosorption är en annan teknik som möjliggör insamling av slemhinna slemhinnan vätskan för att bedöma luftväg medlare33. Även denna teknik (kräver bronkoskopi) är mer invasiv än inducerad sputum, har fördelarna med att undvika någon kontamination med saliv och att erhålla högre koncentrationer av mediatorer än i bronkoalveolär lavage33.
Kritiska steg behöver uppmärksamhet i protokollet. Först, måste försiktighet iakttas om saline koncentrationen och induktion, eftersom dessa två parametrar kan påverka resultaten och måste därför vara standardiserade34,35. Andra är mucolysis med DTT ett viktigt steg för behandlingen. Jämfört med PBS visades DTT att bättre skingra slem celler7, vilket förbättrar cytopsin bild kvaliteten och är viktigt att ha en reproducerbar cell count2. Mucolytic agenten kan dock störa mätningen av biokemiska komponenter.Tillsatta experiment bör då utföras vid mätning en ny biokemiska sammansatta36. Slutligen är ett annat viktigt steg av förfarandet cellen räknar steg som måste utföras av en utbildad tekniker att säkerställa tillförlitlig och tolkningsbara resultat.
En alternativ metod med slem pluggar (klibbig eller tätare delar), i stället för hela sputum, beskrivs också i den litteratur7. Båda teknikerna har fördelar och nackdelar. Hela sputum tekniken tillåter snabbare bearbetning7, men är ofta förorenade med saliv, vilket späder ut provet och kan minska kvaliteten på cytospins2,7. Med plug urval teknik reduceras saliv föroreningen, vilket innebär att prover är ofta av bättre kvalitet för dosering av vätska fas mediatorer och cytospin bilder7. Behandlingen är dock längre7 och markerade kontakter kan inte är representativa för hela provet37. Det är också värt att notera att inte alla prover som innehåller pluggar, som kan vara begränsande. Båda metoderna har validerats och reproducerbara, och det finns för närvarande inga bevis att differential cell räkningarna från båda dessa metoder är olika14,38.
I framtiden, skulle inducerad sputum kunna användas som ett kliniskt verktyg för att ge biomarkörer för utredning, diagnos och hantering av alla typer av inflammatoriska luftvägssjukdomar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av universitet sjukhus Lièges (CHU Liege). Vi erkänner ”ögonblickar productions” för video produktion. Vi erkänner också Cedric François, patienten som dök upp i filmen.
Spirometer – Spirobank | MIR France | ||
Salbutamol MDI – Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0135-913 | See drug available in the country |
Nebulizer UltraNeb | DeVilbiss Healthcare USA | UltraNeb U3000 | |
Devilbiss UltraNeb Disposable Cups & Lids | DeVilbiss Healthcare USA | 100HD-647 | |
DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers | DeVilbiss Healthcare USA | 1001005879 | |
One-way Valves | Hudson RCI USA | 41664 | |
One-way Valves | Hudson RCI USA | 41665 | |
Aerosol T-connector | Hudson RCI USA | 41077 | |
Ventilation circuit monobranch corrugated | Int'Air Medical France | TA30A | |
NaCl 5 % | / | / | Produced by our hospital pharmacy |
Mini-Plasco NaCl 0.9% | B.Braun Medical Diegem Belgium | ||
Salbutamol sulfate 5 mg/mL – Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0094-987 | See drug available in the country |
Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL – Atrovent | Boehringer Ingelheim Germany | CNK: 1543-305 | See drug available in the country |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | LONZA Belgium | BE17512F | |
Sputolysin reagent | Calbiochem | 56000 | |
Trypan blue 0.4% solution 100 mL | LONZA Bio Whittaker Belgium | 17-942E | |
Hemocytometer – Thoma chamber | Labor Optik Lancing UK | 1500000 | |
Hemacolor Stainig set | Merck Belgium | 1116610001 | Alternative product : Diff Quik Staining Set Medion Diagnostic |
Mounting medium – Entellan | Merck Belgium | 107960 | |
Statspin Cytofuge 12 | Beckman Coulter Belgium | X00-003066-001 |