מערכות מכוננת Inducible עבור שינוי גנטי In Vivo של העכבר Hepatocytes באמצעות הזרקת וריד הזנב Hydrodynamic
Summary
הזרקת וריד הזנב hydrodynamic של וקטורים אינטגרציה מבוססת-transposon מאפשרת יציבה תרביות תאים של hepatocytes מאתר ויוו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעשית למערכות תרביות תאים המאפשרת ביטוי מכוננת ארוכת טווח של transgene יחיד או ביטוי מכוננת ו דוקסיציקלין-inducible משולב של transgene או של מיר-shRNA בכבד.
Abstract
במודלים המחקר של סרטן הכבד, התחדשות, דלקת, פיברוזיס, מערכות גמיש ויוו ביטוי גנים והשתקה שימושיות מאוד. הזרקת וריד הזנב hydrodynamic של המבנים מבוססי transposon היא שיטה יעילה עבור הנדסה גנטית של hepatocytes בעכברים בוגרים. בנוסף לביטוי transgene המכונן, מערכת זו יכול לשמש ליישומים מתקדמים יותר, כגון בתיווך shRNA גן במשתמע דפיקה למטה, את מערכת CRISPR/Cas9 כדי ליצור מוטציות או מערכות inducible. כאן, השילוב של הביטוי CreER מכוננת יחד עם ביטוי inducible של transgene או מיר-shRNA להתמקד מוצג בתור דוגמה של טכניקה זו. אנו מכסים את ההליך רב שלבי החל משלב הכנת היפהפיה הנרדמת-transposon בונה, הזרקה, וטיפול של עכברים, הכנת רקמת הכבד לניתוח על ידי immunostaining. מערכת הציג היא גישה אמין ויעיל להשגת שינויים גנטיים מורכבים ב hepatocytes. היא שימושית במיוחד בשילוב עם זנים העכבר מבוססות-Cre/loxP, ניתן להחיל על מגוון דגמים בחקר מחלת כבד.
Introduction
מחלת כבד כרונית מציג ברחבי העולם נטל1הבריאותיות העיקריים. מחקר בבעלי חיים מודלים כלים מהותיים בחקר מחלת כבד, סייעו לענות על שאלות מורכבות התחדשות כבד, דלקת הכבד, ו steatosis, כמו גם סרטן הכבד2. מספר ניכר של מודלים בבעלי חיים אלה מסתמכים על השינוי הגנטי של תאי כבד. לכן, כלים יעילים לתמרן ביטוי גנים ב hepatocytes הן מועילות3. הוקמה שיטות כגון הרבייה של זנים מהונדסים גנטית עכבר או הדור של וקטורים ויראלי לדלקת hepatocyte נמצאים גם הנמל זמן רב, חששות בטיחות, או תשואה transgene המסכן ביטוי hepatocytes ויוו 4 , 5. הזרקת וריד הזנב hydrodynamic (HTVI) היא שיטה חלופית עבור ויוו תקנים של hepatocytes המאפשר קל, מהיר ויעיל עלות חקירת פונקציה ג’ין בכבד. עבור HTVI, וקטור נושאת את רצף ה-DNA הרצוי הוא מומס נפח תמיסת המתאים ל-10% של משקל הגוף של החיה מוזרק. הפתרון אז מוזרק לווריד הזנב תוך 5-10 s6. העולה על תפוקת הלב, תמיסת המלח זורם מן הכלילי התחתון לתוך הורידים בכבד, המוביל אל הרחבה של הכבד, תרביות תאים hydrodynamic של hepatocytes7. כדי להשיג אינטגרציה הגנומי יציב, השיטה יש כבר בשילוב עם וקטורים מבוססי transposon, כגון מערכת שינה יופי –transposon. מערכות זו שמתווכת על רקומבינציה של וקטורים היעד עם רקומבינציה גנומית אתרים על ידי שינה יופי –transposase8,9. עבור מודלים של פיברוזיס בכבד או carcinogenesis, רצוי לעיתים קרובות כדי גנים overexpress או השתיקה בנקודות זמן מסוימות של מודל המחלה. למטרה זו, כלי ביטוי גנים inducible כגון Cre/LoxP-המערכת או מערכת ביטוי גנים inducible-טטרציקלין (ט-על) עשוי להיות בשימוש10.
כאן, אנו מתארים עבור ויוו תקנים של hepatocytes מאתר באמצעות HTVI של היפהפייה הנרדמת transposon מערכת מבוססת פרוטוקול. בנוסף פרוטוקול לביטוי יציב, המכונן של transgene תחת השליטה של מקדם מכירות ספציפי לכבד, נתאר מערכת וקטור מתקדמים יותר המשלבת ביטוי recombinase (CreER) Cre תלויי-טמוקסיפן מכוננת עם הביטוי inducible של transgene או הותאם-microRNA shRNA (מיר-shRNA), קרא על המנגל ט-מערכת11. במערכת זו וקטור, inducible transgenes או מיר-shRNAs תלויי-טטרציקלין ביטוי הם משובטים לתוך המבוססת על עמוד השדרה עם מערכת השכפול recombinational, המאפשר הדור קלה ומהירה של וקטורים חדש12. מדריך זה מבוסס וידאו מכסה את הכנת וקטורים מתאימים, הזרקת וטיפול של עכברים כדי להשיג את הביטוי transgene/מיר-shRNA inducible והכנת סוף סוף רקמת הכבד לניתוח. השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה תוכנן כדי לאפשר השילוב של כל מערכת עכבר Cre/loxP משולבת עם ביטוי או דפיקה למטה של כל הגנים של בחירה, שהופך אותו מערכת החלים נרחב במחקר של מחלות כבד.
Protocol
Representative Results
Discussion
תרביות תאים של hepatocytes עם הזרקת וריד הזנב hydrodynamic הפכה שיטה הוקמה מאז השקתו לפני יותר מ- 15 שנה6. אמצעי האחסון מוזרק חורג תפוקת הלב, זורם מן הכלילי התחתון לתוך sinusoids של הכבד7, שמוביל תקנים של בערך 10-20%, במקרים מסוימים עד 40% של hepatocytes25,26. גורמ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי דויטשה Krebshilfe, גרמניה (מספר גרנט 111289 כדי UE), הקרן ולוסיל פקארד הבריאות של הילדים (ארנסט, אמיליה גאלו ניחן הבתר – CTSA מספר גרנט UL1 RR025744 מורה). אנו מודים ד ר מארק א קיי על וקטור בונה ותמיכה עצה ניסיוני ומרווה ג’וליאן ד ר עבור עכברים ו ניסיוני.
Materials
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
Riferimenti
- Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
- Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
- Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
- Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029 (2014).
- Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
- Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
- Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
- Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
- Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
- Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
- Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
- Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
- Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
- Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
- Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
- Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
- Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
- Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
- Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
- Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
- Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
- Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
- Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
- Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
- Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
- Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
- Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
- Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
- Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
- Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
- Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
- Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
- Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).
