Гидродинамические хвост инъекции Вену векторов интеграции на основе transposon позволяет Трансфекция стабильная мышиных гепатоцитов в vivo. Здесь мы представляем практический протокол transfection систем, позволяющий долгосрочный учредительный выражение одного трансген или комбинированных учредительных и доксициклин индуцибельной выражение трансген или мир индуцируемый в печени.
В модели исследования рака печени, регенерации, воспаление и фиброз гибкие системы в vivo экспрессии генов и глушителей являются весьма полезными. Гидродинамические хвост инъекции Вену конструкций на основе transposon является эффективным методом для генетических манипуляций гепатоцитов в взрослых мышей. Помимо выражения учредительный трансген эта система может использоваться для более сложных приложений, таких как индуцируемый опосредованной генов нокдаун, последствия ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы, чтобы вызвать мутации гена, или индуцибельной систем. Здесь сочетание учредительный CreER выражения вместе с индуцибельной выражение трансген или мир индуцируемый выбора представлен как пример этой техники. Мы покрываем многоступенчатого процедуры, начиная от подготовки Спящая красавица-transposon конструкции, инъекции и лечении мышей и подготовка ткани печени для анализа на иммуноокрашивания. Представлена система-это надежный и эффективный подход к достижению сложных генетических манипуляций в гепатоцитах. Он специально полезна в сочетании с КРР/loxP основанный мыши штаммов и может применяться для различных моделей в исследовании болезни печени.
Хронические заболевания печени представляет основных медицинских бремя мира1. Исследования животных моделей являются важнейшими инструментами в исследовании болезни печени и помогли ответить на сложные вопросы в регенерации печени, печеночная воспаление и стеатоз, а также рака печени2. Значительное количество этих животных моделей полагаются на генетической модификации клеток печени. Таким образом эффективные инструменты для манипулирования экспрессии генов в гепатоцитах являются полезным3. Установленные методы селекции штаммов генетически модифицированные мыши или поколения вирусных векторов для гепатоцитов инфекции являются либо времени, гавань проблем безопасности, или дают бедным трансген выражение в гепатоциты в естественных условиях 4 , 5. инъекции Вену гидродинамических хвост (HTVI)-это альтернативный метод для в vivo трансфекции гепатоцитов, позволяя легко, быстро и экономически эффективных допрос функции гена в печени. Для HTVI вектор, перевозящих желаемой последовательности ДНК растворяется в объеме физраствора, соответствует 10% от массы тела животного вводят. Решение затем вводят в Вену хвост в течение 5-10 s6. Превышение сердечного выброса, солевой раствор вытекает из нижней полой вены в печени Вены, ведущих к расширению печени и гидродинамические трансфекции гепатоцитов7. Для достижения стабильного геномной интеграции, метод была объединена с transposon основе векторов, например Спящая красота –transposon системы. Эта систем опосредует рекомбинации целевой векторов с сайтов геномной рекомбинации, катализируемые Спящая красота –Транспозаза8,9. Для моделей фиброз печени или канцерогенеза желательно часто overexpress или молчание генов в определенные моменты времени модели болезни. Для этой цели, инструменты для экспрессии генов индуцибильный как LoxP/Cre системы или тетрациклин inducible gene выражение системы (тет-на) может быть используемые10.
Здесь мы описываем протокол в vivo трансфекции мышиных гепатоцитов, используя HTVI системы на базе transposon Спящая красавица . Помимо протокола для стабильного, учредительный выражение трансген под контролем печени конкретной промоутера, мы опишем более продвинутые векторная система, которая объединяет учредительный тамоксифен зависимых Cre рекомбиназа (CreER) выражение с индуцибельной выражение трансген или адаптированных микроРНК индуцируемый (мир индуцируемый), называется pTC тет системы11. В этой системе вектор в основу вектор с recombinational клонирования системы, что позволяет быстро и легко поколения новых векторов12клонируются индуцибельной трансгенов или мир процессируются тетрациклин зависимой выражения. Это видео на основе руководство охватывает подготовку подходящих векторов, инъекции и лечения мышей для достижения индуцибельной трансген/мир индуцируемый выражение и, наконец, подготовка ткани печени для анализа. Чтобы включить сочетание любых Cre/loxP при посредничестве системы мыши с выражением или нокдаун гена любого выбора, что делает его широко применяются системы исследований заболеваний печени был разработан метод, описанный в настоящем Протоколе.
Трансфекция гепатоцитов с гидродинамическим хвост инъекции Вену стал установленным метод с момента ее введения более чем 15 лет назад6. Введенный объем превышает сердечного выброса и перетекает из нижней полой вены в синусоид печени7, ведущих к трансфекции око…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Deutsche Krebshilfe, Германия (номер 111289 Грант для UE), Люсиль Паккард для здоровья детей (Эрнест и Амелия Галло наделены докторантура стипендий – CTSA номер гранта УЛ1 RR025744 для UE). Мы благодарим д-р Марк а. Кей для векторных конструкций и экспериментальной советы и д-р Жюльен Sage для мышей и экспериментальной поддержки.
General Material | |||
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Restriction Enzymes | |||
PacI | New England BioLabs | R0547S | |
AscI | New England BioLabs | R0558S | |
FseI | New England BioLabs | R0588S | |
SacI | New England BioLabs | R0156S | |
SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
NotI | New England BioLabs | R0189S | |
XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Kits | |||
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials for Mouse Experiments | |||
Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |