Inyección en la vena hidrodinámica cola de vectores de integración basado en el transposón permite la transfección estable de hepatocitos murinos en vivo. Aquí, presentamos un protocolo práctico para sistemas de transfección que permite la expresión constitutiva a largo plazo de un solo transgen o expresión constitutiva e inducible de doxiciclina combinada de un transgén o miR-shRNA en el hígado.
En modelos de investigación de cáncer de hígado, inflamación, regeneración y fibrosis, flexible para en vivo gene expresión y silenciamiento son muy útiles. Inyección en la vena hidrodinámica cola de construcciones basadas en el transposón es un método eficiente para la manipulación genética de hepatocitos en ratones adultos. Además la expresión del transgen constitutiva, este sistema puede utilizarse para aplicaciones más avanzadas, como consecuencia de precipitación, shRNA-mediado del gene del sistema CRISPR/Cas9 para inducir mutaciones genéticas, o sistemas inducibles. Aquí, la combinación de la expresión constitutiva de CreER junto con la expresión inducible de un transgen o miR-shRNA de elección se presenta como un ejemplo de esta técnica. Cubrimos el procedimiento de varios paso a partir de la preparación de la bella durmiente-transposon construye, a la inyección y el tratamiento de ratones y la preparación del tejido hepático para su análisis por immunostaining. El sistema presentado es un acercamiento confiable y eficiente para lograr complejas manipulaciones genéticas en los hepatocitos. Es especialmente útil en combinación con cepas de ratón basados en Cre/loxP y puede aplicarse a una variedad de modelos en la investigación de la enfermedad hepática.
Enfermedad del higado crónica presenta una carga de salud importante en todo el mundo1. Modelos de investigación animal son herramientas esenciales en el estudio de la enfermedad hepática y han ayudado a responder preguntas complejas en la regeneración del hígado, inflamación hepática, esteatosis como cáncer de hígado2. Un número considerable de estos modelos animales se basan en la modificación genética de las células del hígado. Por lo tanto, herramientas eficaces para manipular genes en los hepatocitos están útil3. Métodos establecidos, tales como la cría de las cepas de ratón modificados genéticamente o la generación de vectores virales para la infección del hepatocito son o puerto mucho tiempo, preocupaciones de seguridad o rendimiento pobre transgene expresión en hepatocitos en vivo 4 , 5. inyección en la vena hidrodinámica cola (HTVI) es un método alternativo para en vivo de la transfección de hepatocitos permitiendo interrogatorio fácil, rápido y eficiente de la función génica en el hígado. Para HTVI, un vector con la secuencia de ADN deseada se disuelve en un volumen de solución salina correspondiente al 10% del peso corporal del animal inyectado. La solución entonces se inyecta en la vena de la cola dentro de 5-10 s6. Exceder el gasto cardiaco, la solución salina fluye de la vena cava inferior en las venas hepáticas, hacia la expansión del hígado y la hidrodinámica de la transfección de hepatocitos7. Para lograr la integración genómica estable, el método se ha combinado con vectores transposon-basados, tales como el sistema de transposon dormir belleza. Este sistema interviene en la recombinación de vectores objetivo con los sitios de recombinación genómica catalizados por transposasa dormir belleza-8,9. Para los modelos de fibrosis hepática o carcinogénesis, a menudo es deseable que sobrexpresan o silencio genes en ciertos momentos del modelo de la enfermedad. Para ello, herramientas para la expresión de genes inducibles como el sistema Cre/LoxP o el sistema de expresión del gen inducible por tetraciclina (Tet-) pueden ser usados10.
Aquí, describimos un protocolo de la transfección en vivo de hepatocitos murinos utilizando HTVI de un durmiente transposon-sistema. Además de un protocolo de expresión constitutiva, estable de un transgen bajo el control de un promotor específico de hígado, describimos un sistema de vectores más avanzado que combina la expresión constitutiva de recombinase (CreER) de Cre de tamoxifeno-dependiente con la expresión inducible de un transgén o shRNA adaptado de microARN (miR-shRNA), llamado el pTC TET-system11. En este sistema de vectores, los transgenes inducibles o miR-shRNAs de expresión dependiente de la tetraciclina son clonados en el vector de la columna vertebral con un sistema de clonación recombinational, permitiendo la fácil y rápida generación de nuevos vectores12. Esta guía de video abarca la preparación de vectores adecuados, inyección y tratamiento de los ratones para lograr la expresión del transgen/miR-shRNA inducible y finalmente la preparación de tejido hepático para su análisis. El método descrito en este protocolo fue diseñado para permitir la combinación de cualquier sistema Cre/loxP mediada del ratón con la expresión o la precipitación de cualquier gen de elección, lo que es un sistema ampliamente aplicable en la investigación de la enfermedad hepática.
Transfección de hepatocitos con inyección en la vena hidrodinámica cola se ha convertido en un método establecido desde su introducción hace más de 15 años6. El volumen inyectado excede gasto cardiaco y fluye de la vena cava inferior en los sinusoides del hígado7, llevando a la transfección de unos 10-20%, en algunos casos hasta el 40% de hepatocitos25,26. Predictores de una exitosa transfección son el vol…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por la Deutsche Krebshilfe, Alemania (número de licencia 111289 a UE), la Lucile Packard Foundation para la salud de los niños (Ernest y Amelia Gallo dotado Beca Postdoctoral – número de la concesión de la CTSA UL1 RR025744 a UE). Agradecemos a Dr. Mark A. Kay vector construcciones y asesoramiento experimental y Dr. Julien Sage para los ratones experimentales y apoyan.
General Material | |||
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Restriction Enzymes | |||
PacI | New England BioLabs | R0547S | |
AscI | New England BioLabs | R0558S | |
FseI | New England BioLabs | R0588S | |
SacI | New England BioLabs | R0156S | |
SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
NotI | New England BioLabs | R0189S | |
XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Kits | |||
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials for Mouse Experiments | |||
Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |