JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetica

Konstituerande och inducerbara system för genetiska In Vivo modifiering av mus hepatocyter använder hydrodynamiska svans ven injektion

Published: February 02, 2018
doi:
10.3791/56613
, , , , ,
1Department of Medicine II, Klinikum rechts der Isar,Technische Universität München, 2Department of Pneumology, Center for Medicine,Medical Center University of Freiburg

Summary

Hydrodynamiska svans ven injektion av transposon-baserad integration vektorer möjliggör stabil transfection av murina hepatocyter invivo. Här presenterar vi ett praktiskt protokoll för transfection system som möjliggör långsiktiga konstitutiva uttryck för en enda transgenens eller kombinerade konstituerande och doxycyklin-inducerbara uttryck för en transgen eller miR-shRNA i levern.

Abstract

I forskningsmodeller av levercancer, förnyelse, inflammation och fibros är flexibla system för in-vivo genuttryck och ljuddämpning mycket användbar. Hydrodynamiska svans ven injektion av transposon-baserade konstruktioner är en effektiv metod för genmanipulation av hepatocyter som vuxna möss. Utöver konstituerande transgenens uttryck, kan detta system användas för mer avancerade applikationer, såsom shRNA-medierad gen knock-down, implikationen av CRISPR/Cas9 systemet inducerar genmutationer eller inducerbara system. Kombinationen av konstituerande CreER uttryck tillsammans med inducerbara uttryck av en transgen eller miR-shRNA val presenteras här, som ett exempel på denna teknik. Vi täcker det multi-steg förfarande start från beredning av Törnrosa-transposon konstruerar, till injektion och behandling av möss, och utarbetandet av levervävnad för analys av immunfärgning. Systemet presenteras är en tillförlitlig och effektiv metod att uppnå komplexa genetiska manipulationer i hepatocyter. Det är särskilt användbart i kombination med Cre/loxP-baserade mus stammar och kan tillämpas på en mängd olika modeller i forskningen av leversjukdom.

Introduction

Kronisk leversjukdom presenterar en större hälsa bördan i världen1. Forskning på djur modeller är viktiga verktyg i studiet av leversjukdom och har bidragit till att besvara komplexa frågor i levern regenerering, nedsatt inflammation, samt steatos och levercancer2. Ett betydande antal av dessa djurmodeller är beroende av den genetiska modifieringen av leverceller. Därför är effektiva verktyg för att manipulera genuttryck i hepatocyter bra3. Etablerade metoder såsom uppfödning av genmanipulerade mus stammar eller generationen av virala vektorer för hepatocyte infektion är antingen tidskrävande, harbor säkerhetsfrågor eller ge dålig transgenens uttryck i hepatocyter i vivo 4 , 5. hydrodynamiska svans ven injektion (HTVI) är en alternativ metod för in-vivo transfection av hepatocyter vilket möjliggör enkel, snabb och kostnadseffektiv förhör av geners funktion i levern. För HTVI löses en vektor som transporterar önskat DNA-sekvensen i en volym av saltlösning som motsvarar 10% av kroppsvikt injiceras djuret. Lösningen injiceras sedan i svansen ven inom 5-10 s6. Överstigande hjärtminutvolym, rinner saltlösning från den sämre vena cava lever venerna, vilket leder till expansion av levern och hydrodynamiska transfection av hepatocyter7. För att uppnå stabil genomisk integration, har metoden kombinerats med transposon-baserade vektorer, såsom det sovande skönhet –transposon-systemet. Detta system förmedlar rekombination av målet vektorer med genomiska rekombination platser katalyseras av en sovande skönhet –transposase8,9. För modeller av leverfibros eller carcinogenes är det ofta önskvärt att overexpress eller tystnad gener vid vissa tidpunkter av sjukdom modell. För detta ändamål, verktyg för inducerbara genuttryck såsom Cre/LoxP-systemet eller tetracyklin-inducerbara gen uttryck systemet (Tet-på) kan vara begagnade10.

Här beskriver vi ett protokoll för i vivo transfection av murina hepatocyter med HTVI av en Törnrosa transposon-baserat system. Förutom ett protokoll för stabil, konstitutiva uttryck av en transgen under kontroll av en lever-specifika promotorn, beskriver vi en mer avancerade vector-systemet som kombinerar konstituerande tamoxifen-beroende Cre recombinase (CreER) uttryck med den inducerbara uttryck av en transgen eller mikroRNA-anpassad shRNA (miR-shRNA), kallas pTC TET-system11. I denna vector systemet klonas inducerbara transgener eller miR-shRNAs för tetracyklin-beroende uttryck i ryggraden vektorn med ett recombinational kloning system, som tillåter snabb och enkel generering av nya vektorer12. Denna video-baserade guide omfattar utarbetandet av lämpliga vektorer, injektion och behandling av möss att uppnå inducerbara transgenens/miR-shRNA uttryck, och slutligen beredning av levervävnad för analys. Den metod som beskrivs i detta protokoll var utformad så att kombinationen av varje Cre/loxP medierad mus system med uttrycket eller knock-down av någon gen av val, vilket gör det till ett allmänt tillämpliga system i forskning av leversjukdom.

Protocol

Alla djurförsök utfördes enligt riktlinjerna för skötsel och användning av laboratoriedjur och godkändes av ansvariga myndigheter (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland och Stanford institutionsvård djur och använda kommittén, Stanford, CA, USA). En lista över alla plasmider för kloning (steg 1 till 4) föreskrivs i kompletterande tabell S1. 1. kloning av en transgen för konstituerande genuttryck Design primers för transgenens förstärkning13</…

Representative Results

Transfection effekt hydrodynamic svans ven injektion: Procentandelen av murina hepatocyter som är transfekterade hydrodynamiskt av en enda injektion varierar och beror på flera parametrar såsom injektionsvolym, injektion tid, mängden injicerad DNA, och storleken på den injicerade konstruera6, 22,23. Dessutom är transfection effektiviteten generellt lägre i större djur, d…

Discussion

Transfection av hepatocyter med hydrodynamiska svans ven injektion har blivit en etablerad metod sedan introduktionen mer än 15 år sedan6. Den injicerade volymen överstiger hjärtminutvolym och flöden från den sämre vena cava in sinusoider av levern7, leder till transfection på cirka 10-20%, i vissa fall upp till 40% av hepatocyter25,26. Prediktorer för en framgångsrik transfection är den injicerade volyme…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av Deutsche Krebshilfe, Tyskland (licensnummer 111289 till UE), den Lucile Packard Foundation för barns hälsa (Ernest och Amelia Gallo begåvat postdoktorala gemenskap – CTSA licensnummer UL1 RR025744 till UE). Vi tackar Dr Mark A. Kay för vektor konstruktioner och experimentella råd och Dr Julien Sage för möss och experimentell support.

Materials

General Material
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher #SM1331 DNA ladder for electrophoresis
Tissue-Tek O.C.T. Sakura 4583 embedding of cryo-sections
Biozym LE Agarose Biozym 840004
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
D(+)-Saccharose Carl Roth 4621.1 For sweetening of the doxycyline solution
Ampicillin Sodium Salt AppliChem A0839,0010 For selection of Amp-resistant clones
LB Agar (Luria/Miller) Carl Roth X969.1
LB Broth (Luria/Miller) Carl Roth X968.1
S.O.C. Medium Thermo Fischer 15544034
Gentamicin sulfate AppliChem A1492,0001 For selection of Gentamicin-resistant clones
Roti-Histofix 4 % Fa. Roth P087.6 para-formaldehyde solution
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix invitrogen/ThermoFisher 11791-020 contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K
DB3.1 Competent Cells Thermo Fisher 11782-018
Stbl3 Chemically Competent E. coli Thermo Fisher C737303
Name Company Catalog Number Comments
Restriction Enzymes
PacI New England BioLabs R0547S
AscI New England BioLabs R0558S
FseI New England BioLabs R0588S
SacI New England BioLabs R0156S
SpeI New England BioLabs R0133S
KpnI New England BioLabs R0142S
NotI New England BioLabs R0189S
XhoI New England BioLabs R0146S
BfuAI New England BioLabs R0701S
Name Company Catalog Number Comments
Kits
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For DNA Extraction from gel
NucleoSpin Gel and PCR Clean Up Macherey & Nagel 740609.10
NucleoBond PC20 Macherey & Nagel 740571 Plasmid extraction (Mini prep)
NucleoBond PC500 Macherey & Nagel 740574 Plasmid extraction (Maxi prep)
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher F530S
Name Company Catalog Number Comments
Materials for Mouse Experiments
Injekt Syringe F 1 ml Braun 9166017V For intraperitoneal injection
Omnifix Luer 3 ml Braun 4616025V For intravenous injection
Sterican Cannula 24G Braun 4657675
Sterican Cannula 27G Braun 4657705
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648-1G For CreER activation
Corn oil Sigma-Aldrich C8267-500ML Carrier for tamoxifen injections
Doxycycline hyclate AppliChem A2951,0025 Activation of tetracycline-dependent expression
Injekt 10 ml Syringe Braun 4606108V
Filtropur S 0.2 Sarstedt 831,826,001 For filtration of doxycycline
NaCl 0,9% Braun 3200905 Carrier for intravenous injections
Falcon Conical Tube 50ml Corning Life Science 352095
Infrared Lamp N/A N/A For warming of mouse tail
IVIS Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.
pTC n/a Vector for constitutive gene expression, ref. 15
pEN_TTmcs Addgene #25755 Entry vector for inducible gene expression, ref. 19
pEN_TTGmiRc2 Addgene #25753 Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19
pEN_TTmiRc2 Addgene #25752 Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19
pTC ApoE-Tet Addgene #85578 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11
pTC-CMV-Tet Addgene #85577 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
  2. Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
  3. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
  4. Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
  5. Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
  6. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
  7. Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029 (2014).
  8. Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
  9. Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
  10. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  11. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
  12. Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
  13. Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  15. Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
  16. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  17. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
  19. Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
  20. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
  21. Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
  22. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
  23. Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
  24. Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
  25. Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
  26. Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
  27. Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
  28. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  29. Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
  30. Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
  31. Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
  32. Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
  33. Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
  34. Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
  35. Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
  36. Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
  37. Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
  38. Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
  39. Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
  40. Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
  41. Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
  42. Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
  43. Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
  44. Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
  45. Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).

Tags

In VivoGenetic ModificationMouse HepatocytesHydrodynamic Tail Vein InjectionConstitutive SystemInducible SystemCreERShRNAVector ConstructLiver ResearchLiver CancerLiver Regeneration
check_url/it/56613?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Hubner, E. K., Lechler, C., Rösner, T. N., Kohnke-Ertel, B., Schmid, R. M., Ehmer, U. Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection. J. Vis. Exp. (132), e56613, doi:10.3791/56613 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image