هنا، نحن نقدم بروتوكول لثقافة 3D من الفئران الخلايا إطلاق المستمدة من الدماغ، بما في ذلك أستروسيتيس، ميكروجليا، وأوليجوديندروسيتيس. نظهر ثقافة الخلية الأولية وحمض الهيالورونيك ميثاكريلاتيد (حماة) هيدروجيل التوليف وتغليف هامافوتو–البلمرة وخلية وعينه تجهيز للتصوير المجهري الإلكترون [كنفوكل] والمسح.
في الجهاز العصبي المركزي وعديدة الإصابات الحادة واضطرابات الأعصاب، كذلك مزروع الأجهزة أو المواد الحيوية هندسيا لتعزيز وظيفة تؤدي إلى نفس النتيجة: التهاب الزائدة يؤدي إلى الدباق، سيتوتوكسيسيتي، و/أو تشكيل ندبة الدبقية جماعياً إلى تفاقم الإصابة أو منع الاسترداد صحية. بقصد إنشاء نظام نموذجي ندبة الدبقية تشكيل ودراسة العمليات التحريضية، ونحن قد ولدت سقالة خلية 3D قادرة على السكن الأساسي استزراع الخلايا الدبقية: microglia التي تنظم استجابة جسم غريب، والشروع الحدث التحريضية و astrocytes التي تستجيب لتشكيل ندبة ليفية أوليجوديندروسيتيس التي تكون عادة عرضه للإصابة التحريضية. هذا العمل يوفر طريقة مفصلة خطوة بخطوة لتصنيع، والثقافة، وتوصيف مجهرية من السقالة على أساس حمض الهيالورونيك 3D المائية مع الفئران مغلفة الخلايا الدبقية المستمدة من الدماغ. علاوة على ذلك، أظهرت البروتوكولات لتوصيف تغليف الخلية والسقالة المائية [كنفوكل] الفلورة والمسح الضوئي المجهر الإلكتروني، فضلا عن القدرة على تعديل السقالة مع ركائز النشطة بيولوجيا، مع إدراج خليط تجاري الصفيحة القاعدية لدمج الخلية المحسنة.
التهاب في الجهاز العصبي المركزي (CNS) منذ فترة طويلة تعتبر من السمات مميزة لالحاده (مثلاً، والسكتة الدماغية، والدماغ وإصابات النخاع الشوكي) والمزمنة (مثل الزهايمر، باركنسون ‘s، والأمراض هنتنغتون) إصابة الجهاز العصبي المركزي، ولكن يتزايد الاعتراف كمساهم سببية للأعصاب والاضطرابات العصبية. استمرار أو التهاب غير ملائمة يمكن أن تسبب الإصابة العصبية وديمييلينيشن (مثل التصلب المتعدد)، وتؤثر سلبا على نمو الدماغ (مثلالفصام والتوحد) والدول المزاج (مثلاً، والاكتئاب والقلق ، الهوس الاكتئابي). علاوة على ذلك، رواية استراتيجيات علاجية باستخدام الأجهزة القابلة للغرس (مثلاً.،2،،الدماغ-الكمبيوتر-واجهات13، الدماغ العميق تحفيز4،5، إينتراسبينال ميكروستيموليشن6،،من78،،من910) توليد استجابة التهابات يمكن التنبؤ بها في مجال التفاعل بين الجهاز والجهاز العصبي المركزي مما أدى إلى استجابة الأنسجة الواقية التي يمكن أن تسبب خسارة عدم فعالية أو الجهاز على مدى عمر زرع11. التهاب في الجهاز العصبي المركزي هو عادة بدأتها microglia، التي تعمل كخلايا محصنة ضد المقيمين من الجهاز العصبي المركزي مسؤولاً عن مراقبة الأنسجة واستجابة جسم غريب (استعرضت12). اعتماداً على شدة إهانة، إشارة microglia وتجنيد إضافية الخلية أنواع إلى موقع إصابة. على وجه التحديد، microglia تنشيط أستروسيتيس، التي بدورها تعمل كخلايا الالتهابات الثانوية وشكل حاجزاً واقيا كثيفة تحتوي13،موقع إصابة14. يمكن أيضا بدء Microglia تتالي نشاط في خلايا النظام المناعي الطرفية، والتي يمكن أن تؤدي إلى انهيار BBB السماح بتسلل المناعية (إعادة النظر في مرجع15).
في حالة الأجهزة مزروع في الجهاز العصبي المركزي، قد تلف الأنسجة الناتجة عن الإدراج الجهاز، فضلا عن استمرار وجود الجهاز الخارجية البدء في عملية تسمى تندب الدبقية. في هذه العملية، وتهاجر إلى microglia وتتكاثر في موقع الإصابة. أنها أيضا بدء الإفراج عن العوامل المثيرة لتحييد التهديدات المحتملة وتجنيد الخلايا الدبقية إضافية. وفي وقت لاحق، astrocytes المنشط تصبح الضخامي والبدء في تغليف الجهاز مزروع شكل جدار ليفي مستمر16. يشير إلى التهاب يخدم أيضا لتشجيع انسحاب عمليات العصبية من المناطق المحيطة بعملية الزرع والمجندين في نهاية المطاف الليفية لتعزيز ندبة الدبقية النامية17. أوليجوديندروسيتيس، المسؤولة عن اﻷغماد العصبية في المايلين لتعزيز الموصلية، لا ينجون من هذه العملية ويتم تقسيم الخلايا البعيدة من الزرع ب ندبة18. تندب الدبقية إلى حد كبير يقلل من الدالة وعمر الأجهزة مزروع، خاصة بالنسبة لتسجيل كهربائي، ويخدم في نهاية المطاف إلى الحد من الأداء الوظيفي لواجهات العصبية19.
استغلوا عدة نهج لزيادة توافق مع الحياة والنشاط واجهة الأجهزة مزروع في الجهاز العصبي المركزي20،21،،من2223. استعراض مستفيض يتوفر على تصميم متوافق حيويا لهذه الواجهات العصبية24. وتشمل الاستراتيجيات الأكثر بروزا المحيطة بالقطب مع الطلاء متوافق مثل بولييلثيلينيجليكول (شماعة)، أحماض اللبنيك-co-الجليكوليك (بلجا)25، أو تعزيز مسرى مع البوليمرات الموصلة مثل بولي (الإيثيلين ديوكسيثيوفيني) (بيدوت)، وبوليبيرولي (بي)26،27،،من2829،،من3031. كما استخدمت الطلاء النشطة بيولوجيا توفير إشارات لنمو الأنسجة العصبية باستخدام يغاندس المستمدة من مصفوفات خارج الخلية، بما في ذلك كولاجينس، فيبرونيكتينس، والأحماض هيالورونيك32،33،34 ،35،،من3637. تم استكشاف بيواكتيفيتي هذه الطلاءات كذلك مع نظم الإفراج عن عامل النمو لمحاكاة الخلية الطبيعية إفرازات30،38،39،،من4041 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50-في نفس الوقت، اختارت بعض المجموعات البحثية لإعادة الهندسة الكهربائي، والمرونة، وتكوين لتقليل عدم تطابق الميكانيكية بين الأجهزة والأنسجة51،52،53 ،،من5455،،من5657. بالإجمال، هذه الاستراتيجيات قد تؤدي إلى العديد من التحسينات الواعدة في الجيل التالي من الأجهزة السطح البيني العصبية، لكن التوافق طويلة الأجل قضية مستمرة، وقد أعاقت التقدم بنماذج معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً في فيفو .
يمكن أن تحد من الإنتاجية التجريبية النهج المستندة إلى نموذج الحيوان وزيادة تكاليف اختبار توافق مع الحياة القطب. في المختبر نهج استخدام زراعة الخلايا التقليدية تقنيات تقديم بديل أكثر فعالية من حيث تكلفة، لكنهم فشلوا في تلخيص الكثير من تعقيد التفاعل بين الأجهزة والأنسجة58. على وجه الخصوص، اختبار سطح الطلاء باستخدام حدود الثقافة الخلية 2D النمذجة للهندسة الكهربائي وتأثير عدم تطابق الميكانيكية وميكروموشن ويعتقد أن يسهم في توليد استجابة مضيف تسهم في فشل الجهاز59 , 60.
للتغلب على المشاكل المرتبطة بثقافة الخلية 2D، وضعت الثقافات المائية للخلايا العصبية لمجموعة واسعة من التطبيقات،61من الدراسات الدوائية، لتوجيه الخلايا العصبية التمايز62، لفهم الأمراض 63،مسارات64، أو الطبقات في ثقافة المشارك مع أنواع أخرى من الخلية إلى نموذج الهجرة الخلية، نيوروبروتيكشن، أو إلى نموذج الأنسجة ميكرونفيرونمينتس61. الهلاميات المائية تشكل سهولة في أحجام مختلفة وهندستها يمكن إدراج أنواع عديدة من الثقافات الخلية الأولية أو مخلدة، وهي الغاية قابلة للتحليل باستخدام تقنيات شائعة الاستخدام مثل الأسفار [كنفوكل] مجهرية. لإنشاء نموذج لعملية تندب الدبقية، لدينا مؤخرا نمواً ووصفت نظام هيدروجيل 3D على أساس حمض الهيالورونيك لاختبار الفائق لاستجابة الدبقية لأقطاب مزروع (الشكل 1)65. وهذا النظام له العديد من المزايا المتميزة: 1) يتم تغليف الخلايا الدبقية الأولية (ميكروجليا وأستروسيتيس و oligodendrocytes) في مصفوفة ثلاثية الأبعاد تتكون من بوليمرات حمض الهيالورونيك، وعنصر مصفوفة خارج الخلية ذاتية؛ 2) تصلب مصفوفة يمكن ‘ضبطها’ لإعادة إنشاء الخواص الميكانيكية للدماغ أو أنسجة النخاع الشوكي؛ و 3) يمكن تغليف الخلايا في المصفوفة في نهج أعلى مقاعد البدلاء سريع باستخدام فوتوبوليميريزيشن مع الضوء الأخضر، الحد من السمية أثناء التغليف. هذا النظام يتيح للملامح الرئيسية في فيفو توافق مع الحياة: أجهزة تندس في المائية بطريقة مماثلة للأنسجة، ويتم رصد الاستجابة الخلوية للأجهزة مزروع لمجموعة واسعة من المعلمات65. وتشمل هذه الميكانيكية يوجد عدم تطابق بين الأجهزة والدهانات المائية من مختلف الهياكل والبقول التحفيز الكهربائي. ويشمل هذا النظام أيضا oligodendrocyte والسلائف المتصلة بها، والتي غالباً ما تكون الحاضرة والمعينين في ندوب الدبقية. بهم الضرر والموت البلعمه من microglia عاليا يدل على الإصابة التحريضية ونموذج تخفيض تندب أو الاسترداد، لديهم القدرة على إثبات re-مييلينيشن من الخلايا العصبية66.
وهنا يصف لنا أسلوباً للتوليف وتشكيل هجين حمض الهيالورونيك الهلاميات المائية جنبا إلى جنب مع تركيبات الغشاء متاحة تجارياً لتحسين إدماج خلية. علاوة على ذلك، سوف نظهر إدراج الخلايا الدبقية مثقف الابتدائي (ميكروجليا وأستروسيتيس و oligodendrocytes) وتحليل لنمو ثقافة استخدام إيمونوسيتوتشيميستري والفحص المجهري [كنفوكل].
نحو تحقيق هدف توليد نظام ثقافة ثلاثية الأبعاد إلى طراز بيوريكتيفيتي الدبقية وعملية تندب الدبقية، قمنا بتطوير نظام يمكن أن تدعم microglia مثقف الأولية، أستروسيتيس وأوليجوديندروسيتيس ويمكن توصيف قوية للخلية التفاعلات مورفولوجيا وخلية خلية. من ميكروجرافس هو مبين، كان مورفولوجية كل نوع خلية ا?…
The authors have nothing to disclose.
الكتاب ممتنون للدعم المالي من الأموال و CFI، عيس، والخدمات الصحية في ألبرتا والهبات ديفي “أبحاث الدماغ”.
1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 – 1.8 X 10^6 |
Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
Dissector scissors – slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
Surgical scissors – Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |