Dirigida la inmovilización de la proteína ósea morfogenética 2 a superficies sólidas por química del tecleo
Summary
Biomateriales dopados con hueso Morphogenetic Protein 2 (BMP2) se han utilizado como una nueva estrategia terapéutica para sanar fracturas sin unión. Para superar los efectos secundarios resultantes de una liberación incontrolable del factor, proponemos una nueva estrategia para sitio-directamente inmovilizar el factor, creando materiales con mayor capacidad osteogénica.
Abstract
Diferentes estrategias terapéuticas para el tratamiento de defectos de hueso largo no han sido investigados intensivamente. Actualmente se utiliza tratamientos presente varias limitaciones que han llevado a la utilización de biomateriales en combinación con factores de crecimiento osteogénicos, como proteínas morfogenéticas óseas (BMPs). Utilizado métodos de absorción o encapsulación requieren supra fisiológicas de BMP2, típicamente resultando en un efecto de liberación de supuesto estallido inicial que provoca efectos secundarios adversos severos varias. Una posible estrategia para resolver estos problemas sería acoplar covalentemente la proteína al andamio. Por otra parte, acoplamiento debe realizarse de manera específica con el fin de garantizar un resultado de producto reproducible. Por lo tanto, hemos creado una variante de BMP2, en el cual un aminoácido artificial (propargyl-L-lisina) fue introducido en la parte madura de la proteína de BMP2 por la expansión del uso de codon (BMP2-K3Plk). Bmp2-K3Plk fue junto a granos funcionalizados mediante cicloadición de azidas catalizada cobre-alquino (CuAAC). La actividad biológica de la juntada K3Plk de BMP2 fue demostrada en vitro y la actividad osteogénica de los granos de BMP2-K3Plk-functionalized fue probada en ensayos de células base. Los granos funcionalizados en contacto con las células C2C12 fueron capaces de inducir la expresión de fosfatasa alcalina (ALP) en proximidad local restringido del grano. Así, mediante esta técnica, se pueden producir andamios funcionalizados que pueden desencadenar la diferenciación celular hacia un linaje osteogénico. Además, dosis más bajas de BMP2 son suficientes debido a la orientación controlada de BMP2 acoplado dirigida. Con este método, BMPs están siempre expuestos a sus receptores en la superficie celular en la orientación apropiada, que no es el caso si los factores se juntan mediante técnicas de acoplamiento no-dirigida. El resultado del producto es altamente controlable y, por lo tanto, resultados en materiales con propiedades homogéneas, mejora su aplicabilidad para la reparación de tamaño crítico hueso defectos.
Introduction
El objetivo final de regeneración del tejido óseo ingeniería y hueso es superar las desventajas y limitaciones que se producen durante tratamientos comunes de fracturas sin unión. Auto o allo trasplantes se utilizan predominante como estrategias actuales de terapia, aunque ambos tienen varios inconvenientes. El injerto óseo ideal debe inducir osteogénesis osteoinduction como osteoconducción, llevando a la osteointegración del injerto en el hueso. Hoy en día, sólo auto-trasplante se considera como el “gold standard” ya que proporciona todas las características de un injerto óseo ideal. Por desgracia, también presenta aspectos negativos importantes, tales como tiempos de cirugía larga y un segundo sitio de trauma que generalmente conlleva más complicaciones (p. ej., dolor crónico, las formaciones de hematoma, infecciones, defectos cosméticos, etc.). Injertos alogénicos, por otro lado tienen características subóptimas para todos aspectos generales1. Tecnologías de injerto de hueso alternativos han mejorado en los últimos años, con el objetivo de producir andamios Osteoinductor, osteoconductive, biocompatible, y bioabsorbibles. Puesto que muchos biomateriales no muestran todas estas características osteogénicos, diferentes factores de crecimiento, principalmente BMP2 y BMP7, se han incorporado para mejorar el potencial osteogénico del andamio especial2.
Como un criterio esencial, tales sistemas de suministro de factor de crecimiento deberá proporcionar una versión de dosis controlada con el tiempo para facilitar las citas imprescindibles como el reclutamiento celular y accesorio, crecimiento celular y angiogénesis. Sin embargo, BMP así como otros factores de crecimiento osteogénicos han sido comúnmente inmovilizados no covalente3. Técnicas de colocación de trampas y adsorción requieren el uso de cantidades supra fisiológicas de proteína debido a un lanzamiento del estallido inicial, que conduce a graves desventajas en vivo, que afecta típicamente a los tejidos circundantes mediante la inducción de crecimiento excesivo de hueso, Osteólisis, la hinchazón y la inflamación4. Por lo tanto, la retención de factores de crecimiento en el sitio de entrega para períodos más largos de tiempo puede lograrse por métodos de inmovilización covalente. Modificar químicamente BMP2 (succinylated5, acetilado6 o biotinilado7), ingeniería de heterodímeros8o BMP2 oligopéptidos derivados9 han sido diseñados y utilizados para superar las limitaciones relacionadas con absorción. Sin embargo, la bio-actividad de estas construcciones no es predecible, ya que el arreglo potencialmente inhibe el atascamiento del ligand inmovilizado a los receptores celulares. Según lo demostrado previamente, es esencial que todas las cuatro cadenas de receptor implicadas en la formación de complejos ligando-receptor activado interactuarán con la BMP2 inmovilizados para activar completamente todo aguas abajo de cascadas de señalización10.
Para superar los problemas de un resultado de producto no homogéneo con limitaciones en términos de bioactividad, la estabilidad y biodisponibilidad del factor inmovilizado, se diseñó una variante BMP capaz de enlace covalente andamios de manera dirigida. Esta variante, denominada BMP2-K3Plk, incluye un aminoácido artificial que fue introducido por codón genético extensión11. Esta variante se ha relacionado con éxito con andamios utilizando una estrategia de acoplamiento covalente mientras que mantiene su actividad biológica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generar variantes de la proteína etiquetado por expansión del codón genético permite la introducción de varios análogos de aminoácidos no naturales principalmente en cualquier posición de la secuencia primaria. En el caso de BMPs como BMP2, común clave como una etiqueta 6-histidina (su) sólo puede ser introducida N-terminal, puesto que el final de protein´s C-terminal se entierra dentro de la estructura terciaria de la proteína y por lo tanto no es accesible desde el exterior. En otras posiciones, el tamaño …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Dr. M. Rubini (Konstanz, Alemania) para proporcionar el plásmido codificación pyrrolysyl-tRNA y para proporcionar pRSFduet-pyrtRNAsynth codificación el correspondiente aminoacil-tRNA sintetasa.
Materials
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | — | — | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | — | — | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | — | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | — | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3– (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | — | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge – 5417R | Eppendorf | — | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | — | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | — | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler – Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | — | PCR |
| TxRed – microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
Riferimenti
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