Isolation og respiratoriske målinger af mitokondrier fra Arabidopsis thaliana
Summary
Mitokondrier er kun en lille procentdel af anlægget celle, skal de være renset for en række undersøgelser. Mitokondrier kan isoleres fra en bred vifte af anlæg organer ved homogenisering, efterfulgt af differentiale og tæthed gradient centrifugering at opnå et højt oprenset mitokondrie brøkdel.
Abstract
Mitokondrier er væsentlige organeller involveret i mange metaboliske omsætningsveje i planter, især produktionen af adenosin trifosfat (ATP) fra oxidation af reduceret forbindelser såsom nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) og flavin adenin dinucleotid (FADH2). Den komplette anmærkning af Arabidopsis thaliana genom har etableret det som mest udbredte plante modelsystem, og dermed behovet for at rense mitokondrier fra en lang række organer (blade, rod eller blomst) er nødvendige for fuldt ud at udnytte værktøjerne, er nu tilgængelige for Arabidopsis at studere mitokondrie biologi. Mitokondrier er isoleret ved homogenisering af væv ved hjælp af en bred vifte af tilgange, efterfulgt af en række differential centrifugering trin producere en rå mitokondrie pellet, der er yderligere renset ved hjælp af kontinuerlig kolloid tæthed farveforløb centrifugering. Kolloid tæthed materiale fjernes efterfølgende ved flere centrifugering trin. Startende fra 100 g friske blade væv, kan 2-3 mg af mitokondrier rutinemæssigt opnås. Respiratorisk eksperimenter på disse mitokondrier vise typiske satser for 100-250 nmol O2 min-1 mg samlede mitokondrie protein-1 (NADH-afhængige sats) med mulighed for at bruge forskellige substrater og hæmmere for at afgøre, hvilken substrater oxideres og kapaciteten af de alternative og cytokrom terminal oxidases. Denne protokol beskriver en isolation metode af mitokondrier fra Arabidopsis thaliana blade ved hjælp af kontinuerlig kolloid tæthed gradienter og en effektiv respiratorisk målinger af renset plante mitokondrier.
Introduction
Mitokondrie planteforskning historie går tilbage over 100 år1. Intakt mitokondrier blev først isoleret i begyndelsen af 1950 ‘ erne ved hjælp af differentieret centrifugering. Fremkomsten af en kolloid tæthed farveforløb i 1980 ‘ erne tillod mitokondrier skal renses uden lider osmotisk justering. Mens gradient renset mitokondrier er velegnet til de fleste formål, på grund af følsomheden af massespektrometri, selv forholdsvis mindre forurenende stoffer kan registreres og kan være uhensigtsmæssigt tildelt en mitokondrie placering2. Brug af frie flow elektroforese kan fjerne både plastidic og Peroxisom forurening3, men frie flow elektroforese er en højt specialiseret teknik og er ikke påkrævet for det store flertal af undersøgelser. Desuden, hvornår placering af et protein, det skal være husket at dobbelt statsborgerskab eller flere målretning af proteiner opstår i celler. Over 100 dobbelt målrettede proteiner er beskrevet for grønkorn/plastids og mitokondrier4og en række proteiner målrettet til mitokondrierne og peroxisomerne er også kendt for5. Udflytning af proteiner under bestemte stimuli, f.eks. oxidativ stress, er desuden et spirende tema i celle biologi6. Således, placeringen af proteiner skal overvejes i forbindelse med biologi studerede, og en bred vifte af tilgange bruges til at bestemme og kontrollere placering2.
Mitokondrier er typisk isoleret fra plantevæv ved homogenisering, en balance er nødvendig mellem bryde åbne cellevæg at frigive mitokondrier, og ikke skadelige mitokondrier. Traditionelt, med kartofler og blomkål indebærer homogenisering at bruge husstand blender/juicer apparater til at gøre en flydende ekstrakt i en buffer med forskellige komponenter til at opretholde aktiviteterne. Isolering af mitokondrier fra ært blade, (et populært materiale til mitokondrie isolation ved hjælp af unge planter (~ 10 dage gammel), udnytter en blender til lyse celler som blade materiale er blødt. Med tilgængeligheden af Arabidopsis thaliana T-DNA pattedyrsceller knock-out linjer, har behovet for at være i stand til at rense mitokondrier at foretage funktionelle studier nødvendiggjort udvikling af metoder til at isolere mitokondrier fra blade, rod og blomst væv. Overordnede arbejdede metoder udviklet for andre planter godt7, med den perquisite, slibning af materialet skulle være optimeret. For Arabidopsis dette kan opnås i en række forskellige måder (se nedenfor), og adskiller sig mellem vævstyper (rod versus skyde). Brugen af den kontinuerlige forløb kan også optimeres som tætheden af mitokondrier fra forskellige organer eller udviklingsstadier betyder, at de kan overføre forskelligt. Således kan tætheden af gradienten for maksimal adskillelse raffineres sikre for at opnå bedste adskillelse.
Når renset, mitokondrier kan bruges til en lang række undersøgelser, herunder protein og tRNA optagelse eksperimenter, enzym aktivitet assays, respiratorisk kæde målinger og vestlige skamplet analyser. Isolerede mitochondrier kan også bruges til massespektrometri analyser af protein overflod. Målrettet flere reaktion overvågning (MRM) analyser giver mulighed for kvantificering af defineret proteiner, men kræver betydelig assay udvikling. Derimod giver kvantificering af dimethyl eller andre isotop etiketter8, discovery tilgang i at identificere forskelle på tværs af hele proteomet, der kan bruges til at afdække nye biologiske indsigter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolering af mitokondrier fra Arabidopsis efterlader typisk, udbytter op 3 mg af mitokondrier fra ca 80-100 3 – 4 – uger gamle planter, selv om udbyttet af større end 5 mg kan ofte opnås med grundig slibning. Udbyttet afhænger af vækstbetingelser og falder drastisk som efterlader senesce, selv om mitokondrier struktur synes at være godt vedligeholdt under gulne9. En af de mest kritiske funktioner til at få et godt udbytte er metoden til slibning for at lyse celler for at frigive mitokondrier…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af en australsk forskning Rådet Centre of Excellence i anlægget energi biologi CE140100008, en australsk forskning Rådet fremtid Fellowship (FT130100112) til MWM og en Feodor Lynen Research Fellowship (Alexander von Humboldt Foundation, Tyskland) til JS.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
Riferimenti
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code – Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O’Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I – complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
