Come i mitocondri sono solo una piccola percentuale della cellula vegetale, hanno bisogno di essere purificato per una serie di studi. I mitocondri possono essere isolati da una varietà di organi vegetali di omogeneizzazione, seguita da centrifugazione in gradiente di differenziale e densità per ottenere una frazione altamente purificata mitocondriale.
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Articolo metodologico
Isolamento e misure respiratoria dei mitocondri da Arabidopsis thaliana
In questo articolo
Sommario
Abstract
I mitocondri sono organelli essenziali coinvolto in numerose vie metaboliche in piante, in particolare la produzione di adenosina trifosfato (ATP) dall'ossidazione di composti ridotti come nicotinamide adenindinucleotide (NADH) e la flavin adenina dinucleotide (FADH2). L'annotazione completa del genoma di Arabidopsis thaliana ha stabilito come il più diffuso sistema pianta modello, e così la necessità di purificare i mitocondri da una varietà di organi (foglia, radice o fiore) è necessaria per utilizzare pienamente gli strumenti che sono ora disponibili per Arabidopsis studiare biologia mitocondriale. I mitocondri sono isolati di omogeneizzazione del tessuto utilizzando una varietà di approcci, seguita da una serie di passaggi di centrifugazione differenziale producendo un pellet mitocondriale grezza che viene ulteriormente purificato mediante gradiente di densità colloidale continuo centrifugazione. Il materiale di densità colloidale viene successivamente rimosso da più passaggi di centrifugazione. A partire da 100 g di tessuto fogliare fresco, 2-3 mg di mitocondri possono essere ottenuti ordinariamente. Respiratori esperimenti su questi mitocondri visualizzare i tassi tipici di 100-250 nmol O2 min-1 mg proteina mitocondriale totale-1 (tasso di NADH-dipendente) con la possibilità di utilizzare vari substrati e inibitori per determinare quali substrati sono sono ossidati e la capacità delle alternative e citocromo ossidasi terminale. Questo protocollo descrive un metodo di isolamento dei mitocondri da foglie di Arabidopsis thaliana usare gradienti di densità colloidale continuo e un'efficiente misure respiratoria dei mitocondri pianta purificata.
Introduzione
La storia della ricerca mitocondriale pianta ripercorre 100 anni1. I mitocondri intatti in primo luogo sono stati isolati all'inizio del 1950 mediante centrifugazione differenziale. L'avvento di un gradiente di densità colloidale nel 1980 ha permesso i mitocondri per essere purificata senza subire regolazione osmotica. Mentre gradienti mitocondri purificati sono adatti per la maggior parte degli scopi, a causa della sensibilità della spettrometria di massa, contaminanti anche relativamente minore possono essere rilevati e possono essere assegnati in modo inappropriato un mitocondriale posizione2. L'uso del libero flusso ....
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Protocollo
Questo protocollo viene utilizzato per l'isolamento dei mitocondri intatti da organi di Arabidopsis thaliana coltivati su terreno con pendenze di densità colloidale continuo. La raccolta del materiale di seguito tutte le procedure sono effettuate a 4 ° C.
1. preparazione di macinatura media, lavare, soluzioni tampone e gradienti
- Preparare 300 mL di macinazione medio (meno ascorbato e cisteina) e 200 mL di tampone di lavaggio x 2 per ogni tabella 1 un giorno prima l'isolamento, tenerli freddo a 4 ° C.
Nota: Aggiungere ascorbato di sodio e la L-cisteina (base libera) a una concentrazione finale di 17,84 ....
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Risultati
Usando questo protocollo, siamo stati in grado di rilevare diverse proteine mitocondriali di SDS-PAGE e immunoblotting. Come mostrato in Figura 3A, la proteina isolata dal tessuto di coltura di acqua è sufficiente per rilevare una debole banda (2 µ g). L'intensità del segnale aumenta in proporzione agli importi caricati. Per i mitocondri isolati dai tessuti coltivati sulle piastre (Figura 3B), la risposta allo stress di luce alta.......
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Discussione
In genere, isolamento dei mitocondri da Arabidopsis lascia rendimenti a 3 mg di mitocondri da circa 80-100 3 - 4 - settimana-vecchi impianti, anche se rese superiori a 5 mg possono essere realizzate spesso con accurata macinazione. Il rendimento varia con le condizioni di crescita e diminuisce drammaticamente come foglie ratti senesce, anche se i mitocondri struttura sembra essere ben mantenuto durante la senescenza9. Una delle caratteristiche più importanti per ottenere una buona resa è il metodo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da un australiano ricerca Consiglio centro di eccellenza in pianta energia biologia CE140100008, un australiano Consiglio futuro assegno di ricerca (FT130100112) di MWM e un assegno di ricerca di Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fondazione, Germania) a JS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chimico |
| Antimicina A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chimico, sciogliere in etanolo |
| l'anticorpo AOX | da Tom Elthon Elthon | et al., 1989 | |
| Ascorbato | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbato ossidasi da Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chimica |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chiarezza chimica |
| substrato ECL occidentale | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Criterio chimico |
| Gel prefabbricati senza macchie 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chimico |
| cianuro | Sigma-Aldrich | 60178 | chimico |
| Citocromo c | Sigma-Aldrich | C3131 | |
| Chimico Difco Agar, granulato | BD Biosciences | 214530 | Chimico |
| Ditiotreitolo | Sigma-Aldrich | D0632 | Chimico |
| EDTA sale disodico | Sigma-Aldrich | E5134 | Chimico |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chimico |
| Soluzione vitaminica Gamborg (1000x) | Austratec | G219-100ML | IgG |
| anti-topo chimico (H + L)-HRP coniugato | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | IgG |
| anti-coniglio chimico di capra (H + L)-HRP coniugato | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | |
| L-cisteina | Sigma | C7352-100G | |
| solfato | di magnesio chimicoSigma-Aldrich | 230391 | |
| Chemical Murashige & Skoog Miscela di sali basali (MS) | Austratec | M524-100L | Chimico |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chimico, sciogliere in etanolo |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chimico |
| Ndufs4 anticorpo | da Etienne Meyer Meyer | et al., 2009 | |
| n-Propil gallato | Sigma-Aldrich | P3130 | Chimico, sciogliere in etanolo |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chimico, gradiente di densità colloidale |
| Polivinilpirrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chimico |
| Cianuro di potassio | Sigma-Aldrich | 60178 | Chimico |
| Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chimico |
| Piruvato | Sigma-Aldrich | P2256 | Chimico |
| Cloruro di sodio | Chem-Supply | SA046 | Chimico |
| Ditionito di sodio | Sigma-Aldrich | 157953 | Chimico |
| L-ascorbato di sodio | Sigma | A4034-100G | |
| Chimico Succinato | Sigma-Aldrich | S2378 | Chimico |
| Saccarosio | Chimico | SA030 | Chimico |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | |
| Pirofosfato tetrasodico chimico (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trans-Blot chimico Turbo RTA Midi Kit di trasferimento di nitrocellulosa | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chimico, detergente |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical Balance |
| Mettler Toledo | XS204 | Attrezzatura | |
| Becher | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuga | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | |
| Attrezzatura Provette da centrifuga | Nalgene | 3117-9500 | Attrezzatura |
| Julabo | 1124971 | Attaccato a camera dell'elettrodo di ossigeno | |
| Pallone conico | Isolab | 500 mL | |
| Contagocce | 3 mL | ||
| Rotore ad angolo fisso | Beckman Coulter | JA25.5 | Attrezzatura |
| Imbuto | Per Alimenti | 14 cm | Per filtrazione |
| Versatore a gradiente | Bio-Rad | 165-4120 | Per la preparazione di gradienti |
| Agitatore magnetico ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Materiale filtrante |
| Mortaio e pestello | Jamie Oliver | Granito, 6 pollici | Attrezzatura |
| O2view | Hansatech Instruments | Software di monitoraggio dell'ossigeno | |
| Sistema Oxygraph Plus | Hansatech Instruments | 1187253 | Elettrodo di ossigeno di tipo Clark |
| Pennello | Artista prima scelta | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | film plastico di paraffina |
| Pompa peristaltica | Gilson | F155001 | Per la preparazione di gradienti |
| Tubo peristaltico in PVC | Gilson | F117930 | Per la preparazione di gradienti Bagno |
| d'acqua | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
Riferimenti
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell
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Ristampe e permessi
