अलगाव और Arabidopsis थालियाना से Mitochondria की श्वसन माप
Summary
के रूप में mitochondria केवल संयंत्र सेल का एक छोटा सा प्रतिशत हैं, वे अध्ययन की एक सीमा के लिए शुद्ध किया जाना चाहिए । Mitochondria homogenization द्वारा संयंत्र अंगों की एक किस्म से अलग किया जा सकता है, विभेदक और घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा पीछा करने के लिए एक उच्च शुद्ध mitochondrial अंश प्राप्त करते हैं ।
Abstract
Mitochondria पौधों में कई चयापचय रास्ते में शामिल organelles आवश्यक हैं, सबसे विशेष रूप से nicotinamide adenine dinucleotide (नध) और फ्लेविन adenine जैसे कम यौगिकों के ऑक्सीकरण से adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) का उत्पादन dinucleotide (फॊध2). Arabidopsis थालियाना जीनोम की पूरी एनोटेशन यह सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल संयंत्र मॉडल प्रणाली के रूप में स्थापित किया है, और इस प्रकार के अंगों की एक किस्म (पत्ती, जड़, या फूल) से mitochondria को शुद्ध करने की आवश्यकता है पूरी तरह से उपकरणों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है कि अब mitochondrial बायोलॉजी के अध्ययन के लिए Arabidopsis के लिए उपलब्ध हैं । Mitochondria ऊतक के homogenization द्वारा दृष्टिकोण की एक किस्म का उपयोग कर अलग कर रहे हैं, अंतर केंद्रापसारक एक कच्चे mitochondrial गोली है कि आगे सतत कोलाइडयन घनत्व ढाल का उपयोग कर शुद्ध है उत्पादन कदम की एक श्रृंखला के बाद अपकेंद्रित. कोलाइडयन घनत्व सामग्री बाद में कई केंद्रापसारक कदम से हटा दिया है । ताजा पत्ती ऊतक के १०० जी से शुरू, mitochondria के 2-3 मिलीग्राम नियमित रूप से प्राप्त किया जा सकता है । इन mitochondria पर श्वसन प्रयोगों १००-२५० nmol ओ की विशिष्ट दरों प्रदर्शन2 मिनट-1 मिलीग्राम कुल mitochondrial प्रोटीन-1 (नध-निर्भर दर) विभिन्न सब्सट्रेट और अवरोधकों का उपयोग करने की क्षमता के साथ निर्धारित करने के लिए जो सब्सट्रेट ऑक्सीकरण किया जा रहा है और वैकल्पिक और cytochrome टर्मिनल oxidases की क्षमता । यह प्रोटोकॉल सतत कोलाइडयन घनत्व ढाल और शुद्ध संयंत्र mitochondria के एक कुशल श्वसन माप का उपयोग कर Arabidopsis थालियाना पत्तियों से mitochondria की एक अलगाव विधि का वर्णन ।
Introduction
संयंत्र mitochondrial अनुसंधान के इतिहास १०० साल1से अधिक वापस चला जाता है । बरकरार mitochondria पहले 1950 के दशक में विभेदक केंद्रापसारक का उपयोग कर अलग थे । 1980 के दशक में एक कोलाइडयन घनत्व ढाल के आगमन mitochondria परासरणी समायोजन दुख के बिना शुद्ध होने की अनुमति दी । जबकि ढाल शुद्ध mitochondria अधिकांश प्रयोजनों के लिए उपयुक्त हैं, मास स्पेक्ट्रोमेट्री की संवेदनशीलता के कारण, यहां तक कि अपेक्षाकृत मामूली दूषित पदार्थों का पता लगाया जा सकता है और अनुपयुक्त एक mitochondrial स्थान2असाइन किया गया हो सकता है । मुक्त प्रवाह ट्रो का उपयोग दोनों plastidic और peroxisome संदूषण3दूर कर सकते हैं, लेकिन मुक्त प्रवाह ट्रो एक अति विशिष्ट तकनीक है और अध्ययन के विशाल बहुमत के लिए आवश्यक नहीं है । इसके अलावा, जब एक प्रोटीन के स्थान का निर्धारण यह याद है कि दोहरी या प्रोटीन के कई लक्ष्यीकरण कोशिकाओं में होता है की जरूरत है । १०० से अधिक दोहरी लक्षित प्रोटीन chloroplasts/plastids और mitochondria4के लिए वर्णित हैं, और mitochondria और peroxisomes को लक्षित प्रोटीन की एक संख्या भी जाना जाता है5। इसके अलावा, विशिष्ट उत्तेजनाओं के तहत प्रोटीन का पुन: स्थान, oxidative तनाव उदा , सेल बायोलॉजी6में एक उभरते विषय है । इस प्रकार, प्रोटीन का स्थान अध्ययन करने के लिए जीव विज्ञान के संदर्भ में विचार किया जाना चाहिए, और दृष्टिकोण की एक किस्म का निर्धारण और स्थान की पुष्टि करने के लिए उपयोग किया जाता है2.
Mitochondria आम तौर पर homogenization द्वारा संयंत्र के ऊतकों से अलग कर रहे हैं, एक संतुलन Mitochondria जारी करने के लिए सेल दीवार खोलने तोड़ने के बीच की आवश्यकता है, और Mitochondria को नुकसान नहीं. परंपरागत रूप से, आलू और फूलगोभी के साथ, homogenization गतिविधि बनाए रखने के लिए विभिन्न घटकों के साथ एक बफर में एक तरल निकालने के लिए घरेलू ब्लेंडर/जूसर उपकरण का उपयोग करना शामिल है । मटर के पत्तों से mitochondria का अलगाव, (mitochondrial युवा अंकुर का उपयोग कर अलगाव के लिए एक लोकप्रिय सामग्री (~ 10 दिन पुरानी), पत्तियों सामग्री के रूप में लाइसे कोशिकाओं के लिए एक ब्लेंडर का इस्तेमाल नरम है । की उपलब्धता के साथ Arabidopsis थालियाना T-डीएनए सम्मिलनी नॉक आउट लाइनों, करने के लिए कार्यात्मक अध्ययन बाहर ले जाने के लिए mitochondria शुद्ध करने के लिए सक्षम होने की जरूरत है, पत्ती, जड़ या फूल से mitochondria को अलग करने के लिए तरीकों का विकास आवँयक है ऊतक. कुल मिलाकर अंय पौधों के लिए विकसित तरीके7अच्छी तरह से काम किया, सुविधा के साथ कि सामग्री के पीसने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । Arabidopsis के लिए इस तरीके की एक किस्म में प्राप्त किया जा सकता है (नीचे देखें), और ऊतक प्रकार (जड़ बनाम गोली मार) के बीच अलग है । लगातार ढाल का उपयोग भी विभिंन अंगों या विकास के चरणों से mitochondria के घनत्व के रूप में अनुकूलित किया जा सकता है मतलब है कि वे अलग से स्थानांतरित कर सकते हैं । इस प्रकार, अधिकतम जुदाई के लिए ढाल का घनत्व सबसे अच्छा जुदाई को प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए परिष्कृत किया जा सकता है ।
एक बार शुद्ध mitochondria अध्ययन की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रोटीन और tRNA के साथ मिलकर प्रयोगों, एंजाइम गतिविधि परख, श्वसन श्रृंखला माप और पश्चिमी दाग विश्लेषण भी शामिल है । पृथक mitochondria भी प्रोटीन बहुतायत के जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । लक्षित कई प्रतिक्रिया निगरानी (MRM) विश्लेषण परिभाषित प्रोटीन के ठहराव के लिए अनुमति देता है, लेकिन महत्वपूर्ण परख विकास की आवश्यकता है । इसके विपरीत, dimethyl द्वारा ठहराव या अन्य आइसोटोप लेबल8, पूरे proteome में अंतर की पहचान करने में एक खोज दृष्टिकोण प्रदान करता है जिसका उपयोग उपंयास जैविक अंतर्दृष्टि को उजागर करने के लिए किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
आमतौर पर, अलगाव से mitochondria के Arabidopsis पत्तियों की पैदावार 3 mitochondria से मिलीग्राम लगभग ८०-१०० ३-4 सप्ताह पुराने पौधों, हालांकि अधिक से अधिक की पैदावार 5 मिलीग्राम अक्सर पूरी तरह से पीसने के साथ प्राप्त किया जा सकता ह?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के एक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद में उत्कृष्टता के केंद्र संयंत्र ऊर्जा जीवविज्ञान CE140100008, एक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद भविष्य फैलोशिप (FT130100112) MWM के लिए, और एक फ़ेयोडोर Lynen रिसर्च फैलोशिप (अलेक्जेंडर वॉन पीरु द्वारा समर्थित किया गया था फाउंडेशन, जर्मनी) जे एस के लिए ।
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
Riferimenti
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