分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定
Summary
ミトコンドリアは、植物細胞のわずかな割合は、彼ら研究の範囲を精製する必要があります。ミトコンドリアは、均質化、続いて高純度ミトコンドリア分画を取得する微分と密度勾配遠心法によってさまざまな植物器官から分離できます。
Abstract
ミトコンドリアは植物、特にニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NADH) やフラビン アデニンなど削減化合物の酸化からアデノシン三リン酸 (ATP) の生産の多くの代謝経路に関与する重要な細胞内小器官型 (FADH2)。シロイヌナズナのゲノムの完全な注釈が確立して最も広くプラント モデルを使用し、したがってさまざまな器官 (葉や根、花) からミトコンドリアを浄化するために必要なツールをフル活用する必要があること今ミトコンドリアの生物学を研究するシロイヌナズナ用があります。ミトコンドリアは、様々 なアプローチ、続いて連続コロイド密度勾配を使用して更に精製粗ミトコンドリア ペレットを生産差動遠心分離手順の一連を使用して組織の均質化によって分離します。遠心分離。コロイド密度材料がその後複数の遠心分離手順によって削除されます。新鮮な葉のティッシュの 100 g から始まって、ミトコンドリアの 2-3 mg 日常的に取得できます。これらのミトコンドリアの呼吸実験阻害剤及び各種の基材を使用しているを確認する能力を持つ 100 250 nmol O2分-1 mg ミトコンドリア蛋白-1 (NADH 依存率) の典型的な率を表示します。基板を酸化と代替とチトクローム ターミナル オキシダーゼの容量。このプロトコルでは、シロイヌナズナ葉連続コロイド密度勾配および精製された植物ミトコンドリアの効率的な呼吸測定を使用してからミトコンドリアの分離法について説明します。
Introduction
植物ミトコンドリア研究の歴史は、100 年1以上さかのぼります。無傷ミトコンドリアが 1950 年代初頭に隔離された最初差動遠心分離を使用します。1980 年代におけるコロイドの密度勾配の出現は、浸透圧調節を受けることがなく精製するミトコンドリアを許可しました。グラデーション精製ミトコンドリアは質量分析法の感度のためのほとんどの目的に適しているも比較的軽微な汚染物質検出することができます、不適切なミトコンドリアの場所2を割り当てることができます。プラスチド局在型の両方を削除フリーフロー電気泳動することができますの使用とペルオキシソーム汚染3、無料が、フローの電気泳動は専門性の高い技術と研究の大半には必要ありません。さらに、そのデュアルまたは複数のターゲット蛋白質の思い出したする必要がある蛋白質の場所を決定するときにセルに発生します。葉緑体/プラスチドとミトコンドリアの4、およびミトコンドリア標的蛋白質の数の以上 100 デュアル ターゲットタンパク質を説明し、ペルオキシソームでは5が知られています。さらに、特定の刺激、酸化ストレスなどの下で蛋白質の再配置は、細胞生物学6新興テーマです。このように、蛋白質の位置を学び、生物学の文脈で検討する必要が、さまざまなアプローチ、決定および場所2を確認します。
ミトコンドリア、通常の均質化によって植物組織から分離されて、バランスがミトコンドリアを解放する細胞壁を壊して開けるとミトコンドリアを損傷されていない間必要です。伝統的に、ジャガイモとカリフラワー、均質化は、活動を維持するためにさまざまなコンポーネントのバッファーで抽出液を作る家庭用ミキサー/ジューサー装置を使用します。エンドウ葉からミトコンドリアの分離 (稚苗 (~ 10 日古い) を使用してミトコンドリアの分離のための普及した材料は、葉材が柔らかくて、細胞を溶解するミキサーを利用しています。シロイヌナズナT-DNA 挿入ノック アウトの行の可用性と機能研究を実施するミトコンドリアを浄化することができる必要がある葉、根、花からミトコンドリアの分離法の開発組織。全体的に他の植物の開発方法を最適化するために必要な材料の研削役得で、よく7に働いた。シロイヌナズナのこれはさまざまな方法 (下記参照) で達成することができます、組織の種類 (撮影対ルート) によって異なります。さまざまな器官からミトコンドリアの密度として連続的な勾配の使用を最適化することも、または発達段階を意味する彼らは別様に移行することができます。したがって、最大分離のためグラデーションの密度は、洗練された最高の分離を達成するためにことを確認することができます。
一度精製したタンパク質、tRNA の吸収実験、酵素活性測定法、呼吸鎖測定および西部のしみの分析を含む研究のさまざまなミトコンドリアを使用ことができます。ミトコン ドリアは、蛋白質量の質量分析にも使用できます。複数の反応 (MRM) 分析を監視可能の定量化タンパク質を定義しますが、重要な分析法の開発を必要とする対象となります。これに対し、ジメチルまたは他同位体ラベル8による定量化は、生物学的知見を明らかにする使用することができます全体のプロテオームの間での違いを識別するに発見アプローチを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
通常、シロイヌナズナからミトコンドリアの分離は徹底的な研磨と 5 mg を超える利回りが得られますが約 80-100 の 3 – 4 週間の古い植物からミトコンドリアの 3 mg を利回りを残します。収量は生育条件によって異なります、老化9の中にも維持されるように思われますがミトコンドリアの構造は、senesce の葉、劇的に減少します。良好な収率を取得する最も重要な機能の 1 つは?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究、オーストラリア研究協議会優秀センターのプラント エネルギー生物学 CE140100008、オーストラリア研究協議会未来フェローシップ (FT130100112) を MWM とフョードル ・ リュネン研究員 (アレクサンダー ・ フォン ・ フンボルトによって支えられました財団、ドイツ) JS に。
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
Riferimenti
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