Isolasjon og respiratoriske målinger av mitokondrier fra Arabidopsis thaliana
Summary
Mitokondrier er bare en liten prosentandel av anlegget celle, trenger de å bli renset for en rekke studier. Mitokondrier kan isoleres fra forskjellige plante organer ved homogenisering, etterfulgt av differensial og tetthet gradert sentrifugering å få en høyrenset mitokondrie brøkdel.
Abstract
Mitokondrier er viktig organelles involvert i mange metabolske veier i planter, særlig produksjon av adenosin trifosfat (ATP) fra oksidasjon av redusert forbindelser som nikotinamid adenine dinucleotide (NADH) og flavin adenine dinucleotide (FADH2). Komplett merknaden i Arabidopsis thaliana genomet har etablert det som mest brukte anlegget modellsystem, og dermed måtte rense mitokondrier fra forskjellige organer (blad, rot eller blomst) er nødvendig for å utnytte verktøyene som er nå tilgjengelig for Arabidopsis å studere mitokondrie biologi. Mitokondrier er isolert av homogenisering av vev ved hjelp av en rekke tilnærminger, etterfulgt av en rekke differensial sentrifugering trinn produsere olje mitokondrie pellets som er videre renset med kontinuerlig kolloidalt tetthet gradert sentrifugering. Kolloidalt tetthet materialet fjernes senere ved flere sentrifugering trinn. Fra 100 g av friske blad vev, finnes 2-3 mg mitokondrier rutinemessig. Åndedretts eksperimenter på disse mitokondrier Vis typiske priser med 100-250 nmol O2 min-1 mg totale mitokondrie protein-1 (NADH-avhengige rate) muligheten til å bruke ulike underlag og hemmere til å bestemme hvilke underlag er å bli oksidert og de alternative og cytochrome terminal oxidases. Denne protokollen beskriver en isolasjon metode for mitokondrier Arabidopsis thaliana blader med kontinuerlig kolloidalt tetthet forløpninger og en effektiv åndedretts målinger av renset anlegget mitokondrier.
Introduction
Mitokondrielt planteforskning historie går tilbake over 100 år1. Intakt mitokondrier ble isolert tidlig på 1950-tallet ved hjelp av differensial sentrifugering. Ankomsten av en kolloidalt tetthet gradert i 1980 tillatt mitokondrier renses uten lidelse osmotisk justering. Mens gradient renset mitokondrier er passer de fleste formål, grunn av sensitiviteten av massespektrometri, selv relativt mindre forurensning kan oppdages og kan tilordnes feilaktig mitokondrie beliggenhet2. Bruk av fri flyt geleelektroforese kan fjerne både plastidic og peroxisome forurensning3, men uten flyt gelelektroforese er en høyt spesialisert teknikk og er ikke nødvendig for det store flertallet av studier. Videre, når bestemme plasseringen av et protein må være husket at to eller flere målretting av proteiner oppstår i celler. Over 100 dobbelt målrettet proteiner er beskrevet for chloroplasts/plastids og mitokondrier4og en rekke proteiner rettet mot mitokondrier og peroxisomes er også kjent for5. Videre er re plasseringen av proteiner under bestemte stimuli, f.eks oksidativt stress, en nye tema i cellen biologi6. Dermed plasseringen av proteiner må vurderes i forbindelse med biologi studerte, og en rekke tilnærminger brukes til å finne og kontrollere plasseringen2.
Mitokondrier er vanligvis isolert fra anlegget vev av homogenisering, kreves en balanse mellom bryte åpne cellen vegg å løslate mitokondrier og ikke skade mitokondrier. Tradisjonelt med potet og blomkål innebærer homogenisering bruk av husholdningenes blender/juicer apparater for å gjøre en flytende ekstrakt i en buffer med ulike komponenter for å vedlikeholde aktivitet. Isolering av mitokondrier ert blader, (et populært materiale for mitokondrie isolasjon med unge frøplanter (~ 10 dager gamle), benytter en blender til lyse cellene som blad er myk. Med anvendeligheten av Arabidopsis thaliana T-DNA insertional banke-ut linjer, har behovet for å kunne rense mitokondrier å gjennomføre funksjonelle studier behov for utvikling av metoder for å isolere mitokondrier blad, rot eller blomst vev. Samlet jobbet metoder utviklet for andre planter godt7, med perquisite som sliping av materialet måtte optimaliseres. For Arabidopsis dette kan oppnås på en rekke måter (se nedenfor), og varierer mellom vev (rot versus skyte). Bruk av kontinuerlig graderingen kan også optimaliseres som tetthet av mitokondrier fra ulike organer eller utviklingsstadier betyr at de kan overføre annerledes. Dermed for maksimal separasjon være tettheten av graderingen raffinerte slik for å oppnå best separasjon.
Når renset mitokondrier kan brukes for en rekke studier, inkludert protein og tRNA opptak eksperimenter, enzym aktivitet analyser, åndedretts kjeden mål og western blot analyser. Isolert mitokondrier kan også brukes for massespektrometri analyser av protein overflod. Målrettet flere reaksjon overvåking (MRM) analyser tillater kvantifisering av definert proteiner, men krever betydelig analysen utvikling. Derimot gir kvantifisering av dimethyl eller andre isotop etiketter8, en oppdagelse tilnærming identifisere forskjeller over det hele proteom som kan brukes å avdekke romanen biologiske innsikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanligvis går isolering av mitokondrier fra Arabidopsis gir opp 3 mg mitokondrier fra ca 80-100 3 – 4 – uke gamle planter, men gir større enn 5 mg oppnås ofte med grundig sliping. Avkastningen varierer med vekst forhold og reduserer dramatisk som forlater senesce, selv om mitokondrier struktur synes å være godt vedlikeholdt under senescence9. En av de viktigste funksjonene for å få en god avkastning er metoden for sliping å lyse cellene å løslate mitokondrier. Mens en rekke mekaniske sli…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av en australsk Research Council kompetansesenter i anlegget energi biologi CE140100008, en australsk Research Council fremtiden Fellowship (FT130100112) ÅRENE og en Fjodor Lynen forskningsstipend (Alexander von Humboldt Foundation, Tyskland) til JS.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
Riferimenti
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code – Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O’Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I – complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
