Isolering och respiratoriska mätningar av mitokondrier från Arabidopsis thaliana.
Summary
Mitokondrierna är endast en liten andel av cellen växt, behöver de renas för en rad studier. Mitokondrier kan isoleras från en mängd växt organ av homogenisering, följt av differential- och täthet lutning centrifugering att erhålla en högrenade mitokondriell fraktion.
Abstract
Mitokondrierna är väsentliga organeller inblandade i många metaboliska vägar i växter, särskilt produktionen av adenosintrifosfat (ATP) från oxidation av reducerade föreningar som nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) och flavin adenin dinukleotid (Fransson2). Komplett annotering av Arabidopsis thaliana genomet har fastställt det som mest använda växten modellsystem, och därmed behovet av att rena mitokondrier från en mängd olika organ (blad, rot eller blomma) är nödvändigt att fullt ut utnyttja verktyg som är nu tillgängliga för Arabidopsis att studera mitokondriell biologi. Mitokondrierna är isolerade genom homogenisering av vävnaden med hjälp av olika metoder, följt av en serie differentiell centrifugering steg producerar en rå mitokondriell pellet som renas ytterligare med hjälp av kontinuerlig kolloidal täthetlutning centrifugering. Kolloidalt densitet materialet avlägsnas därefter genom flera centrifugering steg. Start från 100 g färska löv-vävnad, kan 2-3 mg av mitokondrier erhållas rutinmässigt. Respiratoriska experiment på dessa mitokondrier visar typiska priser 100-250 nmol O2 min-1 mg totalprotein mitokondrie-1 (NADH-anhörigen klassar) med möjlighet att använda olika substrat och hämmare för att avgöra vilka substrat som oxideras och kapaciteten för de alternativa och cytokrom terminal oxidases. Det här protokollet beskriver en metod för isolering av mitokondrier från Arabidopsis thaliana blad med kontinuerlig kolloidal densitetsgradienter och en effektiv respiratoriska mätningar av renat växt mitokondrier.
Introduction
Historien om anläggningen mitokondriell forskning går tillbaka över 100 år1. Intakt mitokondrier isolerades först på tidiga 1950-talet med hjälp av differentiell centrifugering. Tillkomsten av en kolloidal täthetlutning på 1980-talet tillät mitokondrier som renas utan lidande osmotisk justering. Medan gradient renat mitokondrierna är lämplig för de flesta ändamål, på grund av känsligheten hos masspektrometri, även relativt mindre föroreningar kan upptäckas och kan tilldelas felaktigt en mitokondriell läge2. Användning av fritt flöde elektrofores kan ta bort båda plastidic och peroxisomal kontaminering3, men gratis flow elektrofores är en högt specialiserad teknik och krävs inte för den stora majoriteten av studier. Dessutom uppstår när fastställandet av lokalisering av ett protein som den behöver vara ihågkommen som dubbla eller flera inriktning av proteiner i celler. Över 100 dubbla riktade proteiner beskrivs för kloroplaster/plastids och mitokondrier4och ett antal proteiner riktade till mitokondrierna och peroxisomes är också kända5. Dessutom är åter platsen för proteiner under specifika stimuli, t ex oxidativ stress, en framväxande tema i cellbiologi6. Således, platsen för proteiner måste beaktas i samband med biologi studerade, och en mängd olika metoder används för att bestämma och Kontrollera läge2.
Mitokondrierna är normalt isolerade från växt vävnader av homogenisering, det krävs en balans mellan bryta öppna cellväggen att släppa mitokondrier och inte skadar mitokondrierna. Traditionellt, med potatis och blomkål innebär homogenisering att använda hushållens blender/juicer apparater för att göra en flytande extrakt i en buffert med olika komponenter att bibehålla aktivitet. Isolering av mitokondrier från ärt blad, (ett populärt materiellt för mitokondriell isolering använder unga plantor (~ 10 dagar gamla), använder tredjeparts en mixer för att lysera celler som leaf materialet är mjukt. Med tillgängligheten av Arabidopsis thaliana T-DNA insertional knock-out linjer, har behovet av att kunna rena mitokondrierna att utföra funktionella studier nödvändiggjort utveckling av metoder att isolera mitokondrier från blad, rot eller blomma vävnad. Totalt arbetade de metoder som utvecklats för andra växter väl7, med en naturaförmån som slipning av materien som behövs för att optimeras. För Arabidopsis detta kan uppnås på olika sätt (se nedan), och skiljer sig mellan vävnadstyper (root kontra skjuta). Användning av kontinuerlig gradient kan även optimeras som tätheten av mitokondrier från olika organ eller utvecklingsstadier innebär de kan migrera annorlunda. Således, för maximal separation tätheten av övertoningen kan förfinas för att uppnå bästa separation.
En gång renat mitokondrierna kan användas för en mängd studier, bland annat protein och tRNA upptag experiment, enzym aktivitet analyser, respiratorisk kedja mätningar och western blot analyser. Isolerade mitokondrier kan också användas för masspektrometri analyser av protein överflöd. Riktade flera reaktion övervakning (MRM) analyser möjliggör kvantifiering av definierade proteiner, men kräver betydande assay utveckling. Kvantifiering av dimetylfumarat eller andra isotopen etiketter8, ger däremot en discovery strategi i identifiera skillnader över det hela proteomet som kan användas för att avslöja nya biologiska insikter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanligtvis, isolering av mitokondrier från Arabidopsis lämnar räntorna upp 3 mg av mitokondrier från ca 80-100 3 – 4 vecka gamla växter, även om avkastning på mer än 5 mg kan ofta uppnås med noggrann slipning. Avkastningen varierar med tillväxt villkorar och minskar dramatiskt som lämnar senesce, även om mitokondrier struktur verkar vara väl underhållna under åldras9. En av de mest kritiska funktionerna att få en bra avkastning är metoden för slipning för att lysera celler för …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av en australiensisk forskning rådet Centre of Excellence i växten energi biologi CE140100008, en australiensisk forskning rådet framtid gemenskap (FT130100112) till MWM och en Feodor Lynen Research Fellowship (Alexander von Humboldt Foundation, Tyskland) till JS.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
Riferimenti
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code – Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O’Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I – complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
