Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden
Summary
Mitokondri bitki hücre sadece küçük bir yüzdesi olarak, onlar çalışmalar bir dizi için saf gerekir. Mitokondri bitki organları çeşitli Homojenizasyon, son derece saf mitokondriyal kesir elde etmek için Diferansiyel ve yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından takip tarafından ayrılmış olabilir.
Abstract
Mitokondri temel organelleri tesislerinde, en önemlisi adenozin trifosfat (ATP) oksidasyon Nikotinamid adenin dinükleotit (NADH) ve flavin adenin gibi azaltılmış bileşiklerin üretimi çok sayıda metabolik yollar yer vardır dinükleotit (FADH2). Arabidopsis thaliana genomunun tam ek açıklama olarak en yaygın olarak kullanılan bitki modeli sistemi ve böylece mitokondri organları (yaprak, kök veya çiçek) çeşitli arındırmak gerek dolu araçları kullanmak için gerekli olan kurmuştur bu Artık Arabidopsis mitokondrial Biyoloji eğitim kullanılabilir. Mitokondri homojenizasyon yaklaşımlar, daha fazla sürekli kolloidal yoğunluk gradient kullanarak saf bir ham mitokondrial Pelet üreten fark Santrifüjü adımlar bir dizi tarafından takip çeşitli kullanarak doku tarafından izole Santrifüjü. Kolloidal yoğunluk malzeme daha sonra birden çok Santrifüjü adımı tarafından kaldırıldı. 100 g taze yaprak doku başlayarak, 2-3 mg mitokondri rutin olarak elde edilebilir. Bu mitokondri solunum deney 100-250 nmol O2 dk-1 mg toplam mitokondrial protein-1 (NADH bağımlı oranı) tipik oranları hangi belirlemek için çeşitli yüzeyler ve inhibitörleri kullanma yeteneği ile görüntüleme yüzeylerde okside ve alternatif ve sitokrom terminal oxidases kapasitesi. Bu iletişim kuralı mitokondri Arabidopsis thaliana yaprakları sürekli kolloidal yoğunluk gradyanlar ve arıtılmış bitki mitokondri verimli bir solunum ölçümleri kullanarak üzerinden bir yalıtım yöntemini açıklar.
Introduction
Bitki mitokondrial araştırma tarihinin 100 yıl1döner. Sağlam mitokondri ilk 1950’lerin başında izole fark Santrifüjü kullanarak. 1980’lerde kolloidal yoğunluğu Gradyanda gelişiyle mitokondri ozmotik ayarlama suffering olmadan saf izin. Degrade arıtılmış mitokondri kütle spektrometresi, duyarlılık nedeniyle çoğu amaç için uygun olmakla birlikte bile nispeten küçük kirletici maddeleri tespit edilebilir ve uygunsuz bir şekilde mitokondrial konumu2atanabilir. Plastidic her ikisi de kaldırmak kullanımı serbest akışını Elektroforez can ve akış peroxisome kirlenme3, ama özgür Elektroforez alanında son derece uzman bir teknik ve çalışmaları büyük çoğunluğu için gerekli değildir. Ayrıca, ne zaman olması gerekir bir protein konumunu belirleme bu çift veya birden çok hedefleme proteinlerin hatırladı hücrelerinde oluşur. 100’den fazla çift hedeflenmiş proteinler kloroplast/plastitler ve mitokondri4ve çok sayıda mitokondri için hedeflenmiş proteinler için açıklanan ve tanımladıkları da5bilinir. Ayrıca, yeniden yer altında belirli uyaranlara, örneğin oksidatif stres, proteinlerin hücre biyolojisi6‘ gelişmekte olan bir temadır. Böylece, proteinler konumunun biyoloji eğitimi bağlamında dikkate alınması gerekir ve yaklaşımlar çeşitli belirlemek ve konumu2doğrulamak için kullanılır.
Mitokondri homojenizasyon tarafından bitki dokulardan genellikle izole, mitokondri serbest bırakmak için hücre duvarı açık kırma ve mitokondri zarar değil arasında bir denge gereklidir. Geleneksel olarak, patates ve karnabahar, etkinliğini korumak için çeşitli bileşenleri ile bir arabellekte bir sıvı özü yapmak ev blender/meyve sıkacağı cihazları kullanarak homojenizasyon içerir. Mitokondri bezelye yaprakları, düşük yalıtım (genç fidan (~ 10 gün eski), kullanarak mitokondrial yalıtım için popüler bir malzeme yaprak malzeme yumuşak olduğu gibi hücreleri parçalayıcı bir blender kullanır. Arabidopsis thaliana T-DNA insertional knock-out satırları durumu ile fonksiyonel çalışmalar yürütmek için mitokondri arındırmak için ihtiyaç mitokondri yaprak, kök veya çiçek yalıtmak için yöntem geliştirme gerektirdiği doku. Genel olarak diğer bitkiler için geliştirilen yöntemler iyi7, optimize için gerekli olan malzeme taşlama ikramiye ile çalıştı. Arabidopsis için bu çeşitli şekillerde (aşağıya bakınız) elde edilebilir ve doku türleri (kök sürgün karşı) arasında farklılık gösterir. Sürekli degrade kullanımı da farklı organları üzerinden mitokondri yoğunluğu olarak optimize edilebilir ya da gelişim aşamalarında anlamına gelir onlar farklı geçirebilirsiniz. Böylece, en fazla ayrılması için degradenin yoğunluğu en iyi ayrılık ulaşmak için emin olmak için rafine olabilir.
Bir zamanlar saf mitokondri-ebilmek var olmak kullanılmış çalışmalar, protein, tRNA alımını deneyleri, enzim aktivitesi deneyleri, solunum zinciri ölçümleri ve Batı Leke analizleri de dahil olmak üzere çeşitli için. İzole mitokondri de protein bereket kütle spektrometresi analizleri için kullanılabilir. Hedeflenen birden çok tepki (MRM) analizleri izleme sağlayan miktar için proteinler tanımlanmış, ancak önemli tahlil geliştirme gerektirir. Buna ek olarak, miktar Dimetil veya diğer izotop etiketleri8, roman biyolojik anlayışlar ortaya çıkarmak için kullanılan tüm Proteom arasında farklılıklar belirlenmesinde bir keşif yaklaşım sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
5 mg dan büyük verim kez ayrıntılı zımpara ile elde edilebilir genellikle, mitokondri Arabidopsis üzerinden işlemleri olan mitokondri 3 mg kadar verimleri yaklaşık 80-100 3 – 4 – hafta eski bitkiler, bırakır ancak. Verim büyüme koşullarına ile değişiklik gösterebilir ve mitokondri yapısı yaşlanma9sırasında bakımlı görünüyor olsa da senesce, gider önemli ölçüde azalır. İyi bir verim elde etmek için en önemli özelliklerine mitokondri serbest bırakmak hücrelere…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada bir Avustralya Araştırma Konseyi mükemmellik merkezi olarak bitki enerji Biyoloji CE140100008, bir Avustralya Araştırma Konseyi gelecek Bursu (FT130100112) MWM ve Feodor Lynen araştırma bursu (Alexander von Humboldt tarafından desteklenmiştir Vakfı, Almanya) JS için.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
Riferimenti
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code – Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O’Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I – complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
