JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Biologia dello sviluppo

Rask påvisning av Neurodevelopmental fenotyper i menneskelig Neural Precursor celler (NPC)

Published: March 02, 2018
doi:
10.3791/56628
, , , , , , , , ,
1Department of Neuroscience and Cell Biology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics,Rutgers University

Summary

Neurodevelopmental prosesser som spredning, migrering og neurite resultatet er ofte opprørt i nevropsykiatriske sykdommer. Derfor presenterer vi for å raskt og reproduserbar vurdere prosessene neurodevelopmental i menneskelig iPSC-avledet NPCer. Disse protokollene kan også vurdering av virkningene av relevante vekstfaktorer og therapeutics på NPC-utvikling.

Abstract

Menneskelige hjerne utviklingen fortsetter gjennom en rekke nettopp orkestrert prosesser, med tidligere stadier atskilt av spredning, migrering og neurite utvekst; og senere stadier preget av axon/dendrite utvekst og synapse formasjon. I neurodevelopmental lidelser, er ofte én eller flere av disse prosessene forstyrret, fører til unormalt i hjernen dannes og funksjon. Med bruk av menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSC) teknologi har forskere nå rikelig av menneskelige celler som kan differensieres til nesten en celle type, inkludert nerveceller. Disse cellene kan brukes både normale hjernens utvikling og sykdom patogenesen. Flere protokoller bruker hiPSCs modell nevropsykiatriske sykdom bruk terminalt differensiert nerveceller eller bruk 3D kultur systemer kalt organoids. Disse metodene har vist seg uvurderlig i å studere menneskelig sykdom patogenesen, finnes det noen ulemper. Differensiering av hiPSCs i nerveceller og generasjon av organoids er lange og kostbare prosesser som kan påvirke antallet eksperimenter og variabler som kan vurderes. Dessuten, mens etter mitotisk neurons og organoids tillater studiet av sykdom-relaterte prosesser, inkludert dendrite utvekst og synaptogenesis, utelukke de studiet av tidligere prosesser som spredning og overføring. I neurodevelopmental lidelser, som autisme, indikerer rikelig genetiske og evaluering bevis feil i tidlig utviklingsprosesser. Neural precursor celler (NPC), en svært proliferativ celle befolkningen, kan være en passende modell å stille spørsmål om ontogenetiske prosesser og sykdom innvielse. Vi nå utvide metoder lært å studere utviklingen i musen og rotten kortikale kulturene menneskelige NPCer. Bruk av NPCer tillater oss å undersøke sykdom-relaterte fenotyper og definere hvordan ulike variabler (f.eks, vekstfaktorer, narkotika) innvirkning utviklingsprosesser inkludert spredning, migrasjon og differensiering i bare noen få dager. Til slutt kan denne verktøysett brukes i en reproduserbar og høy gjennomstrømming måte for å identifisere sykdom-spesifikke mekanismer og fenotyper i neurodevelopmental lidelser.

Introduction

Bruk av enklere organismer og musen modeller har belyst mekanismer for grunnleggende hjernens utvikling samt sykdom patogenesen. Til tross for disse fremskrittene forblir etiologien mange nevropsykiatriske lidelser unnvikende fordi ikke alle funn i enklere organismer er direkte relevante for kompliserte aspektet av menneskelig sykdom. Videre større kompleksiteten i den menneskelige hjernen ofte gjør det vanskelig å modell menneskelig utvikling og lidelser i dyr. Med evolusjon og utvikling av menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs) teknologi, kan somatiske celler omprogrammeres til stamceller og deretter differensiert i neuronal celler å studere menneskelig sykdom. Fremskritt innen hiPSCs og «omic» teknologier (genomics, transcriptomics, Proteomikk, metabolomics) lover å revolusjonere forståelsen av menneskelige hjernens utvikling. Disse teknologiene nå gjøre mulig en “presisjon medisin”-tilnærming til karakterisering av nevropsykiatriske sykdom på et sak-til-sak grunnlag.

Gjeldende stiften i feltet hiPSC sykdom-modellering er å skille celler i bestemte neuronal subtyper i en monolayer eller bruke et 3D kultur system kalt en organoid til recapitulate aspekter av hjerne utviklingen1,2, 3. Disse systemene har vært utrolig verdifull i å studere og avdekke unike aspekter av menneskelig utvikling og sykdom4,5,6,7. Men krever både neuronal kulturer og organoids ofte hvor som helst fra uker til måneder i kultur før de er klare til å studere. Tidkrevende natur disse protokollene og mengden ressurser som er nødvendig for å opprettholde disse kultur systemene ofte begrense antall eksperimenter som kan utføres og antall variabler (som vekstfaktorer eller narkotika) som kan testes. Videre har mange studier utnytte etter mitotisk neurons og organoids fokusert på prosesser som dendrite utvekst eller synapse formasjon, som oppstår senere i utviklingen. Mens disse prosessene har vært innblandet i patologi utviklingsforstyrrelser lidelser som autisme og schizofreni, er tidligere utviklingsmessige hendelser som skjer før definitive neuronal differensiering også viktig for sykdom patogenesen8 ,,9,,10,,11,,12,,13. Faktisk viser genomisk studier at midt-fosterets perioden, som består av spredning, prosessen utvekst og migrasjon, er spesielt viktig i autisme patogenesen11,14. Dermed er det viktig å studere nevrale stammen og stamfar celle populasjoner å forstå disse tidligere prosesser. Organoid systems, som er vurdert å bedre recapitulate menneskelige hjerne utviklingen på grunn av sin 3D-natur og organisert struktur, inneholder en stamfar basseng som har blitt benyttet for å studere noen av disse tidligere hendelser. Men stamfar befolkningen i organoids er ofte sparsom og mer som radial gliacellene enn neural celler5,15-med stammen eller stamfar. Dermed vil det være gunstig å ha en høy gjennomstrømning metode å studere tidlige stadier av neurodevelopment i et aktivt proliferativ celle befolkningen.

I laboratoriet, har vi laget en protokoll som bruker hiPSC-avledet neural precursor celler (NPC), en blandet befolkning av nevrale stammen og progenitor celler som er svært proliferativ, å studere neurodevelopmental prosesser som spredning, celle migrasjon, og innledende prosess (neurite) forlengelsen. Disse analyser ble utviklet fra teknikker som brukes i vår lab for flere tiår å kunne studere neurodevelopment i rotte og mus kortikale kulturer16,17,18,19,20, 21,22,23. Viktigst, det ble også vist at fenotyper og regulatoriske signaler definert i kultur rotte og musen er svært forutsigende av mekanismer som er aktive i vivo, som angir verdien av disse teknikkene16, 17,18,19,24. Etter innledende differensiering av hiPSCs med NPC tillater disse metodene oss å studere viktige utviklingsprosesser i løpet av dager. Disse metodene har mange fordeler: (1) de krever litt avansert utstyr og er lett å implementere, (2) rekke eksperimentelle gjentak kan gjennomføres i en kort periode, slik at for rask bekreftelse av reproduserbarhet resultater, og (3) kultur variabler som belegg matriser, effekter av vekstfaktorer og aktivitet av narkotika kan testes raskt og kostnadseffektivt. Videre, tar vi nytte av veletablerte rolle ekstracellulære vekstfaktorer som kritisk regulatorer av ulike utviklingsprosesser. NPCer ble utsatt for å velge utviklingsmessige signaler som direkte stimulerer hendelser som spredning, neurite utvekst og celle migrasjon, og har funnet de forbedrer muligheten til å finne feil som ikke er i kontroll forhold19 , 25 , 26 , 27 , 28. likeledes brukervennlighet vurdere narkotika gir en kraftig avenue å vedta presisjon medisin teknikker for å teste effekten av ulike terapeutiske tiltak. Denne protokollen forenkler dermed en høy gjennomstrømning, reproduserbare, og enkel metode for å studere tidlig hjernens utvikling og sykdom patogenesen de mulige gunstige effektene av vekstfaktorer og narkotika på neurodevelopmental fenotyper.

Protocol

1. prosedyrer og Biosafety regjering vedlikehold Biosikkerhet nivå-2 (BSL-2) sikkerhetsprosedyrer Følg institusjonens retningslinjer på arbeide med BSL-2 materialer. Kast BSL-2 materialer i henhold til institusjonens praksis. Angi rom og utstyr som brukes for BSL-2 materialer. Bruk alle personlig beskyttende utstyr (PPE), inkludert Laboratoriefrakk og hansker. Biosikkerhet regjering vedlikehold Bruk en biosafety regjering godkjent…

Representative Results

Ett mål av disse studiene er å definere proliferativ aktiviteten av NPCer, dvs en økning i cellen tallene. Dette oppnås ved å vurdere DNA-syntese av total-celle befolkningen, en høy gjennomstrømming tilnærming som måler inkorporering av radioaktivt tracer tritiated thymidine i celle ekstrakter, og gjenspeiler alle celler i S-fase, enten de er syntetisere i 5 minutter eller hele to timer. I tillegg kan disse analyser fastsettelse av andelen av cellene angir S-fase og total-celle t…

Discussion

Protokollene presenteres her illustrerer raske og enkle metoder for å studere grunnleggende neurodevelopmental prosesser og teste vekstfaktorer og narkotika bruker hiPSC-avledet neural precursor celler. hiPSC teknologi har revolusjonert studiet av patogenesen av neurodevelopmental sykdommer ved å gi oss tilgang til live neuronal menneskeceller fra berørte personer. Faktisk har det vært mange hiPSC studier av neurodevelopmental lidelser inkludert Retts syndrom, Timothy syndrom, Fragile-X syndrom, og schizofreni, som h…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av New Jersey guvernørens Council for medisinsk forskning og behandling av autisme (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie markerer familie Foundation, Mindworks føre stiftelse og jødiske samfunnet grunnlaget for større MetroWest NJ.

Materials

PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 		 ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320 (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139 (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5 (1), 9 (2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47 (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. , (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1 (1), 10 (2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).
  43. . GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017)
  44. . Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017)

Tags

Keywords: Neural Precursor CellsNeurodevelopmental PhenotypesNeural DevelopmentCell CharacterizationCell CultureCell DetachmentCell HarvestingTritiated ThymidineCell ProliferationNeurodevelopmental DisordersNeuropsychiatric DisordersRapid And Reproducible Method
check_url/it/56628?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image